آلکالن فسفاتاز

1- هدف
هدف از تدوین این دستورالعمل، تشریح روند انجام آزمایش فسفاتاز قليايي Alkaline Phosphatase (ALP) می باشد.
2 – دامنه کاربرد
اين دستورالعمل در واحد بیوشیمی برای انجام آزمایش آلکالن فسفاتاز خون ( Alkaline Phosphatase) بر روی نمونه های سرم و پلاسما خون كاربرد دارد.
3 – مسئولیت اجراء
مسئوليت نظارت بر اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول کنترل کیفیت و سوپروایزر می باشد .
مسئوليت اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول واحد بیوشیمی می باشد .

4 – تعاریف
آلکالن فسفاتاز (EC.3.1.3.1) نوعی فسفاتاز است که استرهای آلی اسید فسفریک را در pH قلیایی (9-10/5) هیدرولیز می کند و فسفات را آزاد می نماید. همانند اسید فسفاتاز از دسته آنزیم های هیدرولاز می باشد. آلکالن فسفاتاز آنزیم غشاء سلولی است و در بسیاری از بافت های بدن یافت می شود اما در روده، استخوان، کبد، کلیه و جفت زیاد است و در کبد و استخوان از همه بیشتر است. آلکالن فسفاتاز 8 عدد ایزوآنزیم دارد که در سه گروه جای می گیرند:
1- ایزو آنزم روده ای
2- ایزوآنزیم جفتی
3- ایزوآنزیم غیر جفتی شامل کبدی، ریوی، استخوانی، طحالی و ایزوآنزیم غیر طبیعی یا آتی پیک یا Tumor Isoenzyme یا ایزوآنزیم ریگان (Regan) که در زمان جنینی تولید می شود و بعد از تولد افزایش آن در سرم می‏تواند حاکی از سرطان باشد. این آنزیم به یون Mg++ به عنوان فعال کننده نیاز دارد و برخی از یونهای دیگر از جمله Mn++ و Co2 نیز آنزیم را فعال می کنند.
آکالن فسفاتاز شامل ایزوآنزیم های متعددی از جمله استخوانی (ALP2)، کبدی (ALPI)، روده ای، جفتی و رگان می باشد. نوع جفتی همانند نوع رگان (یک شکل از آلکالن فسفاتاز جنینی شبه جفتی که در برخی از بدخیمی ها بالا می رود) مقاومت شدیدی نسبت به حرارت از خود نشان می دهد. نوع کبدب ایزوآنزیم آلکالن فسفاتاز نیز از شکل استخوانی آن نسبت به حرارت مقاوم تر است. در مواردی که با بیماری مجاری صفراوی و کبدی روبرو هستیم، اندازه گیری گاماگلوتامیل ترانسفراز (GTT) جهت تشخیص قطعی مفیدتر خواهد بود.
آلکالن فسفاتاز در افراد با گروه خونی O یا B بیشتر از افراد با گروه های خونی A یا AB می باشد که به دلیل تفاوت در میزان ایزوآنزیم روده ای می باشد.
آنزیم آلکالن فسفاتاز به عنوان یک تومور مارکر و یا شاخص بیماری های کبدی و استخوانی مطرح می باشد. آلکالن فسفاتاز حساس ترین آزمایش برای متاستاز تومور به کبد می باشد.
برای غربالگری یا پایش درمان اختلال کبد یا استخوان و نیز به عنوان بخشی از پانل روتین کبد یا وقتی که فرد دارای علائم اختلال کبد یا استخوان است، درخواست می شود.
این تست همچنین ممکن است گاهی برای پایش درمان بیماری پاژه (Pagets disease ، دومین بیماری شایع استخوانی پس از پوکی استخوان می باشد که در آن فعالیت استئوکلاستی استخوان یا فعالیت تخریب استخوان افزایش می یابد. تنها یافته شایع در این بیماری می تواند فقط یک ALP بالا باشد) و یا سایر شرایط استخوان، مانند کمبود ویتامین D مورد استفاده قرار گیرد.
• عنوان آزمایش
ALP IFCC Gen.2 ID:0-551
ALP IFCC Gen.2 ID:0-550
• اصول انجام آزمایش
چون این آنزیم نسبتا دارای یک سوبسترای اختصاصی نمی باشد، برای اندازه گیری آن روش های مختلفی ابداع شده است که اختلاف عمده بین این روش ها در غلظت و نوع سوبسترا، تامپون و pH واکنش می باشد. در اکثریت این روش ها از پارا نیترو فنیل فسفات به عنوان سوبسترا استفاده می شود.
p- nitrophenyl phosphate + H2O Alp, Mg, Zn Phosphate + p-nitrophenol
میزان p – نیتروفنل حاصل نسبت مستقیم با فعالیت آلکالن فسفاتاز دارد و با افزایش جذب نوری در 409 نانومتر سنجیده می شود (کالریمتری)
5- شرایط نمونه :
حداقل مقدار نمونه: 100 میکرولیتر
• نوع نمونه :
سرم
پلاسما (هپارینه یا EDTA)
• شرایط نمونه برداری :
ناشتایی شبانه بهتر است اما برای این تست ضرورتی نیست. فقط نوشیدن آب مجاز است.
• شرایط نگهداری و پایداری:
Alp سرم در دمای 25- 15درجه سانتی گراد 7 روز و در دمای 8- 2 درجه سانتی گراد 7 روز و در فریزر دو ماه پایدار می باشد.
توجه: در صورت مشاهده ذرات یا رسوب در نمونه ابتدا آن را سانتریفیوژ کنید و از قسمت رویی برای آزمایش استفاده نمایید.
• شرایط رد یا قبول نمونه :
– عدم وجود بر چسب مشخصات نمونه
– مناسب نبودن لوله نمونه
– نامناسب بودن شرایط حمل نمونه
– همولیز : تا اندیکس 140 کنترل وصفی، اثر تداخلی ندارد.
6- مواد ، لوازم و تجهیزات
1- دستگاه اتو آنالایزر Cobas Integra 400 و متعلقات مربوط به آن
2- لوله گاما / میکروکاپ
3- سمپلر و سر سمپلر
4- کیت Alp IFCC Gen 2 ( کیت بزرگ:ALP2L یا کوچک: ALP2S)
5- پارافیلم
6- نمونه سرم، پلاسما (هر تست به 75/2 میکرو لیتر نمونه نیاز دارد.)
7- کنترل PN ,PP
8- کالیبراتور Cfas
9- آب مقطر
7- روش انجام آزمایش
پس از تهیه ورک لیست روزانه، ابتدا نمونه ها را از واحد توزیع سرم تحویل گرفته و در ابتدا شرایط ظاهری نمونه ها را چک نمایید سپس در صورت مناسب بودن شرایط کنترل کیفیت مطابق دستورالعمل کنترل کیفیت آزمایشهای کمی (Quantitative)، نمونه ها جهت انجام آزمایش به دستگاه داده شود.
• کالیبراسیون
جهت کالیبراسیون از cfas استفاده می گردد. پس از هر بار کالیبراسیون باید مجددا نمونه های کنترلی به دستگاه داده شوند. همچنان پس از هر بار سرویس دستگاه (از جمله تعویض پروب) نیز باید کالیبراسیون انجام گردد.
مطابق طرح کنترل کیفیت از کالیبراتور به عنوان نمونه بیمار جهت کنترل صحت استفاده شود و بایاس هر تست محاسبه گردد. هر کدام در حد مجاز نبود باید کالیبر و مجددا کنترل داده شود.
8- کنترل کیفیت :
به دستورالعمل کنترل کیفیت آزمایشهای کمی (Quantitative) مراجعه شود.
• دستورالعمل سریع کنترل کیفیت
در هر run جهت کنترل کیفی از Percinorm 1 (غلظت نرمال) و Percinorme 2 (غلظت پاتولوژیک) استفاده می شود. اعداد بدست آمده برای هر کنترل در منحنی Levey-jennings نقطه گذاری می گردند. در صورتیکه که قانونی نقض شده باشد با توجه به نوع آن اقدام لازم بعمل می آید. به عنوان مثال اگر قانون مربوط به خطای دقتی باشد (مثل 13S,R4S ) بار دیگر کنترل به دستگاه داده می شود. اگر قانون مربوط به خطای سیستماتیک باشد ( مثل 22S, 41S, 10X) احتمالا خطا مربوط به کالیبر نبودن تست می باشد. لذا تست را کالیبر کنید. دوباره کنترل را بدهید. در صورتیکه مشکل همچنان باقیست، معرف (کنترل، کالیبراتور، کیتها ) و دستگاه را چک کنید. به عنوان مثال: ابتدا کنترل جدیدی تهیه کنید. اگر مشکل رفع نشد کالیبراتور جدیدی تهیه کنید اگر مشکل رفع نشد کیت جدیدی را امتحان کنید. اگر مشکل رفع نشد برنامه های مربوط به عملکرد دستگاه را بررسی کنید. چنانچه به نتیجه نرسیدید با شرکت اکبریه تماس بگیرید و مشکل را مطرح نمایید. چنانچه با عدم همکاری شرکت مذبور روبرو شدید با مسئول فنی موضوع را مطرح کنید.
9- نحوه محاسبه نتایج در روش های کمی :
دستگاه به طور اتوماتیک غلظت Alp را محاسبه می کند.
(U/L × 0.0167 = μKcat/L)
10- محدوده مرجع (Reference Interval) :
مرجع :اطلاعات داخلی آزمایشگاه
1 روزه : نوزادان < 250 U/L
2 تا 5 روزه : نوزادان < 231 U/L
6 تا 182 روزه : نوزادان < 449 U/L
183تا 365 روزه : نوزادان < 462 U/L
1 تا 3 سال < 281 U/L
4 تا 6 سال < 269 U/L
7 تا 12 سال < 300 U/L
13 تا 17 سال زن < 187 U/L
13 تا 17 سال مرد < 390 U/L
17 سال به بالا
11- محدوده قابل اندازه گیری Reportable Range :
3 – 1200 U/L
نمونه هایی که غلظت آنها بیشتر از 1200 U/L باشد بصورت اتوماتیک به نسبت 1:5 رقیق می شوند.
12- محدوده هشدار یا مقادیر بحرانی :
این تست با توجه به ماهیت آنالیت آن دارای محدوده هشدار یا بحرانی نمی باشد.
• ملاحظات ایمنی:
• در هنگام کار با نمونه ها حتما ازدستکش استفاده شود پس از پایان کار سطوح کاری با محلول ضدعفونی تمیز شوند.
• محلولهای موجود در کیت تحریک کننده اند. بنابراین از تماس آنها با چشم و دهان خودداری شود.
13- ویژگی های آنالیتیک (خصوصیات و کارآیی آزمایش):
Level 1 Level 2
میانگین 80U/L – 1.33μkat/L 228U/L – 3.8μkat/L
CV Within Run 1.6% 1.8%
CV Between Run 2.8% 2.8%
CV 3.2%
BIAS DBV 6.4%
TE DBV 11.7%
14- محدودیت های انجام آزمایش (منابع بالقوه تغییر پذیری) :
مصرف گوشت سبب افزایش Alp سرم می شود.
در موارد بسیار نادر، Gammopathy، به ویژه نوع IgM، ممکن است نتایج غیر قابل اعتماد داشته باشد.
15- اقدامات بعدی دربرخورد با نتایج غیر طبیعی :
در صورت بیشتر یا کمتر بودن از محدوده مرجع تست با تکرار صحه گزاری می شود و در فرم ثبت نتایج آزمایشات تکراری باید ثبت شود. در صورت مقادیر اندازه گیری شده در محدوده بحرانی قرار گیرد ابتدا باید در فرم ثبت نتایج بحرانی اطلاعات نمونه ثبت شود . سپس مطابق دستورالعمل گزارش دهی نتایج بحرانی اطلاع رسانی لازم صورت می گیرد.
16- عوامل مداخله گر :
معیار: بازیابی در 10% ± مقدار اولیه (سرم و پلاسما)
ایکتروس : تاثیری ندارد.
همولیز : تا Hb = 250 mg/dl اثری ندارد.
لیپمی : تداخلی ندارد.
تاثیر دارو: بدون دخالت در غلظت های درمانی با استفاده از پانل های دارویی مشترک پیدا شد.
• تداخلات دارویی :
برخی از داروها ممکن است روی سطح ALP تاثیر بگذارد. برای مثال، قرص های جلوگیری از بارداری ممکن است سطح آن را کاهش دهند، در حالی که داروهای ضد صرع ممکن است سطح آنرا افزایش دهند.
افزایش : آلوپورینول، آنتی بیوتیک، کلی شی سین، ایندومتاسین، متیل دوپا، تتراسیکلین
کاهش : اگزالات، نیتروفورانتوئین، املاح روی
سایر: ماکروگلوبولینمیا والدن اشتروم ممکن است با نتایج نامطمئن همراه باشد.
17- چگونگی تفسیر نتایج :
بر اساس نوع بیماری، شامل موارد زير ميباشد.
ريكتز (راشیتیسم یا نرمی استخوان بچه ها) و نرمي استخوان: ميزان كلسيم و فسفر سرم پايين يا طبيعي است و آلكالن فسفاتاز ممكن است طبيعي يا افزايش يافته باشد.
افزايش ويتامين D : ممكن است سبب افزايش آلكالن فسفاتاز گردد.
بيماري پاژت استخوان: اغلب فقط آلكالن فسفاتاز افزايش يافته است و معمولاً به بيشترين حد خود ميرسد.
پركاري تيروئيد: با تأثير بر استخوان سبب افزايش آلكالن فسفاتاز ميگردد.
هيپرپاراتيروئيديسم: باعث افزايش آلكالن فسفاتاز ميگردد.
مصرف مزمن الكل: در اين موارد آلكالن فسفاتاز طبيعي يا افزايش يافته است اما اغلب با افزايش AST، بيليروبين، MCV, GGT همراه است.
انسداد صفراوي: افزايش 10 برابري در موارد كانسر سر پانكراس و سنگهاي مجاري صفراوي مشاهده ميگردد. در موارد كلستاز، GGT نيز افزايش مييابد. در بيماران مبتلا به كلهسيستيت و كلانژيت كه سنگي داخل مجراي صفراوي مشترك ندارند، ميزان آلكالن فسفاتاز در حد طبيعي يا اينكه اندكي افزايش يافته است.
سيروز: خصوصاً در سيروز صفراوي اوليه (PBC) افزايش 5 برابر الكالن فسفاتاز مشاهده ميگردد. در اين بيماري آنتيبادي ضد ميتوكندري نيز افزايش مييابد. سطح گاماگلوتاميل ترانسفراز (GGT) و ΄5- نوكلئوتيداز سرمي به موازات آلكالن فسفاتاز افزايش مييابند در حالي كه ALT,AST در سيروز صفراوي اوليه اغلب طبيعي يا كمي افزايش يافتهاند. براي تاييد تشخيص و ارزيابي مرحله بيماري بيوپسي كبد انجام ميگردد.
بيماريهاي ارتشاحي ـ گرانولومي كبد (مانند ساركوئيدوز، سل، آميلوئيدوز، تومورهاي متاستاتيك، آبسه): در مواقعي كه آلكالن فسفاتاز به بيشتر از U/L 1000 رسيده و همچنين مقادير GGT نيز افزايش يافته اما ميزان بيليروبين كمتر از mg/dl 1/0 باشد، تشخيص بيماريهاي ارتشاحي و گرانولومي كبد مانند ساركوئيدوز، بيماريهاي قارچي، سل و لنفوم مطرح ميباشند. در مراحل ابتدايي سيروز صفراوي اوليه و كلانژيت اسكلروزان اوليه نيز بيليروبين طبيعي ميباشد.
هپاتيت: افزايش متوسط ALP در هپاتيت ويروسي ديده ميشود اما افزايش مقادير AST,ALT چشمگيرتر است.
تومورها: كارسينوم سلول كليوي و لنفوم نيز با افزايش ALP همراهند كه نشانگر پيشآگهي نامطلوب در مورد اول است.
علل آلكالن فسفاتاز پايين سرمي: كمكاري تيروئيد، برخي موارد بيماري ويلسون، كمخوني بدخيمي در موارد نادر، هيپوفسفاتمي.
تست هاي تكميلي : AST; ALT; GGT; Bilirubin; Liver panel; Bone markers; Alkaline phosphatase isoenzymes; Bone specific ALP
• موارد افزایش:
افزایش میزان ALP در خون معمولا با بیماری کبدی یا اختلالات استخوان ایجاد می شود. سطوح این آنزیم می تواند تا حد زیادی افزايش يابد، به عنوان مثال در مواردی که یک یا تعدادي مجاری صفراوی مسدود شده اند. افزایش کمتر اين آنزيم در سرطان کبد و سیروز با استفاده از داروهای سمی براي کبد و در هپاتیت دیده می‏شود. هر شرایطی که منجر به تشکیل استخوان اضافي شود، شامل بیماریهای استخوان نظير بیماری پاژه و ساير بيماري ها مانند آرتریت روماتوئید و بهبود شکستگی ها می تواند باعث افزایش سطح ALP شود. کودکان و نوجوانان به طور شاخص دارای سطح ALP خون بالاتري هستند، چون استخوان آنها هنوز در حال رشد است. بارداری می تواند سطح ALP را افزایش دهد. با بهبود شكستگي ها نيز افزايش موقت دیده می شود.
• موارد کاهش:
اگر درمان فرد مبتلا به بیماری پاژه با موفقیت انجام شود، سطح ALP کاهش مي يابد یا به حد طبیعی باز مي گردد. اگر فردی با سرطان استخوان یا کبد، به درمان پاسخ مي دهد، میزان ALP باید کاهش يابد.
مقادير کم ALP ممکن است به طور موقت پس از انتقال خون یا عمل جراحی بای پس قلب دیده شود. کمبود روی ممکن است باعث کاهش سطوح ALP شود. یک اختلال ژنتیکی نادر از سوخت و ساز استخوان به نام hypophosphatasia می تواند باعث پايين آمدن شدید و طولانی مدت سطوح ALP شود.
18- سایر موارد :
ندارد.
19- مراجع و ضمائم
1. بروشور کیت (2008-01, V 2 EN)
2. Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 2007: 21 edition.
3. تفسیر تست های تشخیصی Pagana، 2005.
20 – مدارک مرتبط
جدول CV و Bias مجاز WWW.WESTGARD.COM))
دستورالعمل کار با اتوآنالایزر Cobas Integra400
دستورالعمل کنترل کیفیت آزمایشهای کمی (Quantitative)
ورک لیست
دستورالعمل اقدام اصلاحی و پیشگیرانه
دستورالعمل تشريح روند برخورد با نتايج غير طبيعي
دستورالعمل تشريح نحوه گزارش نتايج بحراني
دستورالعمل موارد مخاطره آميز (ايمني و بهداشتي)
دستورالعمل تشريح روش حفاظت و ايمني کارکنان و ايمني درمحيط آزمايشگاه
دستورالعمل مديريت پسماند آزمايشگاهي