1- هدف:
هدف از تدوین این دستورالعمل، تشریح روند انجام آزمایش اندازه گیریTSH در خون نوزادان میباشد.
2- دامنه کاربرد:
این دستورالعمل در واحد هورمونشناسی برای انجام آزمایش اندازه گیری TSH نوزادان بر روی لکه های خون کاربرد دارد.
3- مسئولیت اجرا:
مسئولیت نظارت براجرای صحیح این دستورالعمل برعهده مسئول کنترل کیفیت و سوپروایزر میباشد.
مسئولیت اجرای صحیح این دستورالعمل برعهده مسئول واحد هورمونشناسی میباشد.
4- تعاریف:
کم کاری مادرزادی تیروئید بیماری خطرناکی است که از هر 800 الی 1200 نوزاد یک نوزاد مبتلا به این بیماری است. در ایران طبق گزارش اگر در طی مدت یک تا دو هفته اول تولد تشخیص داده نشود امکان عقب ماندگی ذهنی به طور برگشت ناپذیر وجود دارد. این کیت جهت اندازه گیری هورمون TSH در لکه خون گرفته شده از نوزادان به کار می رود.
• عنوان آزمایش
Neonatal TSH (Pish Taz Teb)
• اصول انجام آزمایش
این کیت بر اساس روش الایزا ی ساندویچ استوار است. لکه خون خشک شده پس از پانچ در داخل چاهک های پلیت که با آنتی بادی منوکلونال ضد TSH پوشش داده شده اند قرار داده می شود و پس از افزودن بافر استخراج انکوبه می گردد. پس از شستشوی چاهک با محلول شستشو و خارج نمودن لکه و مولکول هلی TSH اتصال نیافته به فاز جامد، آنتی بادی کلونال کونژوگه شده با پراکسیداز به چاهک اضافه میگردد. پس از طی زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو، با افزودن محلول کروموژن سوبسترا رنگ آبی پدید آمده متناسب با غلظت TSH در نمونه می باشد. با افزودن محلول Stop رنگ زرد حاصل شده و آنرا در طول موج 450 nm در مقابل فیلتر رفرانس 630 nm قرائت می گردد.
5- شرایط نمونه:
• حداقل مقدار نمونه:
3-2 قطره خون
• نوع نمونه:
لکه خون شده بر روی کاغذ صافی
• شرایط نمونهبرداری:
نمونه گیری3 الی 5 روز بعد از تولد باید انجام شود. ابتدا پاشنه ی پای نوزاد را با الکل 70 درجه تمیز نمائید. لانست را با ضربه آرام و یکنواخت تا عمق 2.4 میلیمتر در محل خونگیری از پاشنه پا وارد نمائید. قطره اول خون را با گاز استریل پاک کنید، کاغذ صافی را به قطره خون نزدیک نموده تا قطره در مرکز دایره پخش شود.
• شرایط نگهداری و پایداری:
بعد از خون گیری لکه خون باید به صورت افقی در سطحی تمیز و به دور از نور خورشید در دمای اتاق به مدت 3 ساعت خشک گردد. لکه های تهیه شده به مدت 2 ماه در 4 درجه سانتی گراد و به مدت طولانی در -20 Co قابل نگه داری می باشند.
• شرایط رد یا قبول نمونه:
سطح لکه خون با دست تماس پیدا نکند و پارگی یا خراشیدگی در سطح لکه خون ایجاد نشود.
6- مواد، لوازم و تجهیزات:
– الایزا ریدر
– شیکر الایزا
– سمپلر و سرسمپلر
– پانچر (کاغذ سوراخ کن) 3 میلی متری
7- روش انجام آزمایش:
پس از تهیه ورک لیست روزانه و به دما رساندن معرف ها کار را شروع می کنیم.
بدین منظور: محلول شستشوی غلیظ باید به نسبت 1 به 10 با آب مقطر رقیق شود. (یک حجم محلول شستشو و 9 حجم آب مقطر) محلول تهیه شده را می توان به مدت 1 هفته در حرارت 4 Co نگهداری نمود.
1. با استفاده از پانچر مخصوص، نمونه هایی با قطر 3 میلی متر را از لکه های نمونه، کالیبراتور و کنترل ها جدا کرده و داخل چاهک مربوطه بیاندازید. مقدار 100 لاندا از محلول بافر استخراج شده را به هر چاهک اضافه نمائید. محتویات چاهک را با تکان دادن به مدت 30 ثانیه مخلوط نمائید.
2. پلیت را به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر (60 rpm) و یا حداقل 16 ساعت در 4 oانکوبه نمائید.
3. پس از طی زمان انکوباسیون محتویات چاهک ها را تخلیه و 5 بار با 300 لاندا محلول شستشو بشوئید. با برگرداندن پلیت، باقیمانده محلول شستشوی موجود در چاهک ها را با کاغذ نم گیر جذب نمائید.
4. به هر چاهک مقدار 100 لاندا کونژوگه آنزیمی اضافه کرده و پلیت را به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه نمائید.
5. مجددا پلیت را طبق روش بند 3 شستشو دهید.
6. مقدار 100 لاندا محلول سوبسترا رنگزا به هر چاهک اضافه کنید و پلیت را به مدت 15 دقیقه در حرارت اتاق و تاریکی انکوبه نمائید.
7. با اضافه نمودن 100 لاندا محلول متوقف کننده، واکنش را متوقف کرده و جذب نوری چاهک ها را در طول موج 450 nm و در مقابل فیلتر مرجع 630 nm قرائت نمائید.
• کالیبراسیون:
لکه های خون استاندارد در مقابل لکه های تهیه شده از استاندارد WHO با کد 80/558 کالیبر شده است.
8- کنترل کیفیت:
دو کنترل Low و High و یک فیلتر خونی به عنوان Pooled Control به همراه نمونه ها در هر Run کاری گذاشته می شود و عدد به دست آمده از فیلتر خونیPooled Control را وارد برنامه QC می کنیم.
کنترل Low: 2.0-5.0 μIU/mL
کنترل High: 18-40 μIU/m
9- نحوه محاسبه نتایج در روشهای کمّی:
میانگین جذب نوری نمونه ها، کالیبراتور ها و کنترل ها را محاسبه نمائید. جذب نوری را روی محور عمودی و غلظت را روی محور افقی مشخص کرده و منحنی نقطه به نقطه ای از کالیبراتور ها را رسم نمائید. با قرار دادن میانگین جذب نوری نمونه در محور عمودی غلظت هر یک را بر روی محور افقی معین کنید.
10- محدوده مرجع (Reference Interval):
هر آزمایشگاه باید بر اساس جمعیت مورد آزمایش محدوده مرجع خود را تعیین کند. بر اساس آزمایشات انجام شده با حدود اطمینان 95%، حدود مرجع با این کیت کمتر از 5μIU/m تعیین شده است. تمامی نمونه های باغلظت بیشتر از این مقدار باید با روش تائیدی، مورد تائید قرار بگیرند.
11- محدوده قابل اندازهگیری Reportable Range:
0-5 μIU/m
12- محدوده هشدار یا مقادیر بحرانی:
5.5 μIU/m <
** ملاحظات ایمنی:
درحین انجام آزمایش از سیگارکشیدن، خوردن و نوشیدن و مصرف لوازم آرایشی خودداری کنید.
از تماس معرف ها با پوست – دهان و چشم خودداری کنید.
با تمام نمونه ها – کالیبراتور ها – کنترل ها به مشابه یک نمونه بالقوه عفونت زا رفتار کنید.
13- ویژگیهای آنالیتیک (خصوصیات و کارآیی آزمایش):
دقت درون سنجی: با استفاده از لکه خون در غلظت مختلف در یک سری کاری، دقت درون سنجی محاسبه شده است.
Level 1 Level 2 Level 3
Mean μIU/mL 3.4 31.6 92.8
SD 0.31 4.2 7.7
SV(%) 9.1 13.2 8.3
n 20 20 20
دقت برن سنجی: با استفاده از لکه خون در 3 غلظت مختلف دقت برون سنجی محاسبه شده است. هر سری تست به صورت دو گانه انجام شده است.
Level 1Level 2Level 3
Mean μIU/mL 3.25 39 91
SD 0.39 5.7 8.2
SV(%) 12 14.6 9
n 10 10 10
حساسیت: حداقل غلظت TSH قابل تعیین با این کیت بر اساس 3 برابر انحراف معیار جذب نوری کالیبراتور صفر مقدار 1.5 μIU/mL تعیین شده است.
14- محدودیتهای انجام آزمایش (منابع بالقوه تغییرپذیری):
با استفاده از غلظت های مختلف هورمون های FSH، LH، hCG در خون تام و تهیه لکه خون با هیچکدام از هورمون های ذکر شده واکنش متقاطع مشاهده نگردید. اثر هوک با تهیه لکه خون با غلظت 5000 μIU/mL مشاهده نگردید.
آنالیت غلظت مقدار اندازه گیری شده TSH (mIU/L)
hFSH )IU/L) 1000 < 1
hLH (IU/L) 1000 < 1
hCG (IU/L) 100000 < 1
15- اقدامات بعدی در برخورد با نتایج غیرطبیعی:
در صورت قرار گرفتن نتیجه در محدوده بحرانی مطابق دستورالعمل برخورد با نتایج غیر طبیعی و بحرانی عمل شود.
16- عوامل مداخلهگر:
ندارد
• تداخلات دارویی:
ندارد
17- چگونگی تفسیر نتایج:
Normal < 5.5
Abnormal > 5.5
• موارد افزایش:
ندارد
• موارد کاهش:
ندارد
18- سایر موارد:
ندارد
19- مدارک مرتبط:
جدول CV و Bias مجاز
دستورالعمل کار با الایزاریدر
دستورالعمل کار با الایزاواشر
دستورالعمل کار با سمپلر
دستورالعمل کنترل کیفیت سمپلرها
دستورالعمل کنترل کیفیت الایزاریدر
ورک لیست
20- مراجع و ضمائم:
بروشور و کیت
دیدگاه خود را درج کنید