عنوان :
Acidifed Serum lysis Test(Ham test)
موارد کاربرد تست:
جهت بررسي بيماري پاروكسيمال نوكچرنال هموگلوبينوريا( PNH) از اين تست استفاده ميشود.
اساس روش آزمایش:
در اين آزمايش گلبول هاي قرمز بيمار را در مقابل سرم وي و سرم نرمال به عنوان منبع كمپلمان در محيطي كه PH اسيدي (7-5/6) دارد قرار مي دهند .
گلبول هاي قرمز بيماربدليل نقص غشايي در محيط اسيدي (7-5/6 PH=) در حضور كمپلمان بطور غير طبيعي هموليز خواهند شد.
نمونه مورد نیاز دربخش نمونه گیری:
نمونه ارجح خون دفيبرينه است .
نمونه لخته همراه CBC براي انجام تست در آزمايشگاه بكار مي رود.
تذكر :نمونه هاي كه به يكي از اشكال زير به آزمايشگاه ارسال شده نيز قابل قبول است:
خون دفيبرينه –هپارينه- حاوي ضد انعقاد اگسالات- سيتراته وEDTA كه بعد از نمونه گيري سريعا به آزمايشگاه رسيده باشد.
نمونه خون روي ACD و Alsevers solution كه در ˚c4 براي 3-2 هفته نگهداري شده نيز قابل استفاده است.
نوع نمونه مورد نیاز دربخش فنی:
سرم نرمال تازه ودكمپلمان شده و سرم و نمونه CBC بيمار كه تازه تهيه شده باشد.
حداقل مقدار:
1 سي سي سرم بيمار ؛4 سي سي سرم نرمال تازه و 4.5 سي سي نمونه CBC لازم است.
ظرف:
لوله شيشه اي ×75 12
معیار غیر قابل قبول بودن نمونه:
ليز بودن نمونه ها- كهنه بودن نمونه ها.(آزمايش فقط بعد از چند ساعت از نمونه گيري قابل انجام است)
براي بيماراني كه به تازگي خون در يافت كرده اند نمي توان اين آزمايش را انجام داد.
مواد ووسایل مصرفی مورد نیاز:
1- سرم و نمونه CBC بيمار
2- سرم نرمال و سرم Inactive شده نرمال و CBC فرد نرمال
3- اسيد كلريدريك 0.2نرمال (1.8cc از HCL ، %37.5 را با D.Wبه حجم 100cc مي رسانيم .
4- نرمال سالين 9 g/l جهت شستشوي نمونهCBC
5- بن ماري 56°c
6- كيت گروه خوني در صورت موجود نبودن گروه خوني AB
7- لوله ×75 12
8- سمپلر
پروسه انجام آزمایش:
1-لوله 10 سي سي لخته را سانتريفوژ كرده(دور 3000 به مدت 5 دقيقه) سرم را از گلبول جدا كنيد.
CBC -2 بيمار را سانتريفوژ كرده پلاسما را جدا كنيد وگلبولهاي قرمز را سه بار با سرم فيزيولوژي شسته و سوسپانسيون 50% تهيه كنيد.
7 ميلي ليتر خون نرمال به عنوان شاهد و يك عدد CBC از گروه AB كه در مورد بيمار با هر گروه خوني قابل استفاده است به روش فوق تهيه شود.
در صورت عدم وجود گروه AB؛ ABO كه سازگار با خون بيمار باشد به روش فوق تهيه كنيد.
2-هفت عدد لوله كوچك را شماره 1 تا7 شماره گذاري كرده در بن ماري 37 قرار دهيد.
3-بر طبق جدول 0.5 ميلي ليتر سرم نرمال را در لوله هاي 1و2و5و6 و 0.5 ميلي ليتر سرم بيمار را در لوله شماره 3 بريزيد.
4-0.5 ميلي ليتر سرم دكمپلمان شده را در لوله 4و 7 بريزيد. (روش دكمپلمان كردن سرم:
سرم را به مدت نيم ساعت در بن ماري 56˚ اتاق سرولوژي قرار مي دهيم.)
5- 0.05 ميلي ليتر اسيد كلريدريك 0.2 نرمال را به لوله هاي 2و3و4 و6و7 اضافه نمائيد.
6- 0.05 ميلي ليتر از سوسپانسيون گلوبولي بيمار را به لوله هاي 1 تا 4 اضافه وهمان حجم از سوسپانسيون گلبولي نرمال را به لوله هاي5و6و7 اضافه نمائيد. لوله ها را با دقت مخلوط كنيد.
PH مخلوط موجود درلوله هارا چك كنيد كاهش PH باعث ليز برخي از سلولها مي شود ولي سلول قرمز PNH در PH پايين ليز نمي شودو براي فعال شدن مكانيزم ليز آن نياز به PH=6.5-7 مي باشد.
7- تمام لوله ها را به مدت يك ساعت در 37 درجه قرار دهيد.
8- لوله ها را در 1000 دور در دقيقه به مدت 5 دقيقه سانتريفوژ كنيد.
9- محلول رويي در لوله ها را برا ي وجود هموليز بررسي كنيد ودرجه هموليز را به صورت درصد يا x+گزارش دهيد.
بعلاوه مقدار هموليز به روش اسپكتروفتومتري در طول موجnm 540 نيز قابل اندازه گيري است.
حهت خوانش تست به روش اسپكتروفتومتري به نكات زير توجه كنيد:
بلانك: 0.5ml سرم نرمال بكار رفته در آزمايش را براي تهيه بلانك برداريد.
استاندارد:0.05ml از سوسپانسيون سلول نرمال و بيمار را با 0.55ml D.W مخلوط كنيد.
10 عدد لوله برداريد در هر كدام 5ml درابكين بريزيد سپس 0.3ml از سوپرنيتنت لوله هاي تست و كنترل و بلانك و استاندارد را به هر كدام از لوله ها اضافه كنيد و در طول موجnm 540 قرائت نمائيد.
7 6 5 4 3 2 1 شماره لوله
0.5 0.5 0.5 0.5 سرم نرمال تازه
0.5 سرم بيمار
0.5 0.5 سرمInactive شده نرمال
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 HCL 0.2نرمال
0.05 0.05 0.05 0.05 گلبول شسته شده 50% بيمار
0.05 0.05 0.05 گلبول شسته شده 50% نرمال
به مدت يك ساعت در 37° قرار داده سپس در دور 1000 براي 2 دقيقه سانتريفوژ مي كنيم.
– – – – + (30%)+++ Trace(2%) الگوي ليز تست مثبت
p519 Twenty-first Edition of henry´s
Modified from Dacie 2006 p263
روش کالیبراسیون (قابلیت ردیابی):-
کنترل کیفیت انجام آزمایش:
استفاده از كنترل مثبت ومنفي در هر ران كاري الزامي است.
تهيه PNH like Red cells يا كنترل مثبت دست ساز:
با استفاده از مواد شيميايي مختلفي مي توان از خون فرد نرمال كنترل مثبت براي تست PNH ساخت يكي از اين مواد 2-aminoethyl-iso-thiouronium bromide(AET) است.
1-تهيه محلول g/l 8 AET با PH= 8.0(با استفاده از NaOH 5 mol/l)
2-خون نرمال در ضد انعقاد ACD نمونه خون را دو بار با سرم فيزيولوژي g/l 9 شتشو دهيد.
3- يك حجم از پك گلوبولي را با 4 حجم از AET مخلوط كنيد درب لوله را ببنديد و به آرامي مخلوط كنيد وبراي 20-10 دقيقه در 37 درجه قرار دهيد.
4- محلول بدست آمده در مرحله 3 را در چند مرحله با سرم فيزيولوژي شستشو دهيد تا مايع رويي كاملا
بي رنگ شود. در اين صورت سلول بدست آمده جهت كنترل مثبت قابل استفاده است.
5-در لوله هاي شماره 1تا 3 به جاي گلبول شسته شده بيمار از گلبول قرمز كنترل مثبت استفاده شود.
مشخصات کاربری :
دقت:
صحت:
حساسیت:
اختصاصی بودن:
نحوه محاسبه نتیجه به روش کمی:-
محدوده مرجع: Negative
محدوده قابل گزارش: مشاهده هر درجه از ليز.
در PNHمعمولا ً میدان هموليز بين 50-10% بوده و بندرت به %5 نزول و يا %80 صعود مي كند.
جواب مثبت با ليز +3 گزارش مي شود.
اگر لیز در سرمی که کمپلمان آن بواسطه گرما غیر فعال شده است رخ دهد ، تست مثبت تلقی نمی شود چون ممکن است سلولهایی اسفروسیتیک یا سلولهایی که با آنتی بادی حساس شده اند ، دلیل بروز این همولیز باشند.
محدوده هشدار:-
چگونگی تفسیر نتایج:
در غشاء سلولي گلبول قرمز نرمال فاكتور هاي پروتئيني وجود دارند كه مانع از ليز سلول توسط اجزاء كمپلمان مي گردند مهمترين اين فاكتور ها عبارتند از:
CD59: membrane inhibitor of reaction lysis or MIRL
CD55:decay accelerating Factor or DAL
HRF:homologous restriction factor
در گلبول قرمز PNH كمبود اين فا كتورها در در جات مختلفي ديده مي شوند به گونه اي كه اگر سلول قرمزPNH در محيط حاوي كمپلمان و PH=6.5-7 مانند شرايطي كه در تست HAM در آزمايشگاه ايجاد مي كنيم قرار گيرد در جات مختلفي از ليز مشاهده خواهد شد.
تفسير نتيجه 7 لوله بكار رفته در آزمايش:
لوله شماره 1
محتوي لوله :سرم نر مال تازه به عنوان منبع كافي كمپلمان همراه با سلول قرمز بيمار در شرايط بدون اسيد=به دليل نقص در غشاء ممكن است به مقدار خيلي كم ليز مشاهده شود.(در حد Trace یا میدان 2% )
لوله شماره 2
محتوي لوله :سرم نر مال تازه به عنوان منبع كافي كمپلمان همراه با سلول قرمز بيمار در شرايط اسيد ي= به دليل نقص در غشاء سلول در محيط اسيدي به مقدار قابل توجهي ليز مشاهده مي شود.(لیز در حد Trace یا میدان 2% )
لوله شماره3
محتوي لوله :سرم بيمار همراه با سلول قرمز بيمار در شرايط اسيد ي= به دليل نقص در غشاء سلول به مقدار كم(در حد یک مثبت + ) ليز مشاهده مي شود.(بدليل احتمال كمبود كمپلمان در سرم)
توجه:تداخل ديگري كه ممكن است در تست HAM مثبت ديده شود وجود بيماري HEMPAS است. hereditary erythroid multinuclearity associated with a positive acidified-serume test
(Congenital dyserythopoietic)
در لوله شماره 2 كه سرم نر مال بكار رفته در اين بيماري مانند PNH؛ 30%(+3) ليز ديده مي شود اما در لوله شماره 3 كه سرم بيمار بكاررفته ليز مشاهده نمي شود در حالي كه در PNH 1+ است.
و تست سوكروز هموليزيز در اين بيماري منفي است وظهور پروتئين GPI مانند CD55و CD59نرمال است.
توجه: آزمايش Ham يك تست اختصاصي و حساس براي تشخيص بيماري PNH است وبكار بردن تست Sucrose lysis بطور انتخابي ميتواند در تاييد بيماري PNH و عدم وجود بيماري HEMPAS كمك كننده باشد.
در بيماري PNH ؛ Sucrose lysisمثبت ودر بيماري HEMPAS منفي است.
علت ليز گلبول قرمز در اين بيماري وجود نوعي آنتي ژن بر سطح گلبول قرمز بيمار است كه با آنتي بادي از كلاس IgM در حضور كمپلمان موجود در سرم نرمال واكنش مي دهد.
Complement –fixing IgM Ab or anti HEMPAS))
لوله شماره4
محتوي لوله :سرم دكمپلمان شده تازه به عنوان منبع بدون كمپلمان همراه با سلول قرمز بيمار در شرايط
اسيد ي به دليل عدم وجود كمپلمان نبايد ليز مشاهده شود در واقع از اين لوله براي كنترل دكمپلمان بودن سرم ودر نتيجه عدم ليز استفاده مي شود.بنابراین در صورتیکه در این لوله لیز مشاهده شود تست مثبت گزارش نمی شود چرا که ممکن است سلولهای اسفروسیتیک یا سلولهای حساس شده با آنتی بادی عامل بروز لیز باشند.
لوله شماره 5و 6 و 7
به عنوان كنترل منفي براي كنترل خون نرمال بكار رفته استفاده مي شود و در شرایطی که لیز در این لوله ها مشاهده شود، ممکن است بدلیل اشتباه در پروسه انجام آزمایش باشد که در این موارد تست تکرار می گردد.
تستهاي تكميلي:
Acidifed Serum lysis with Additional magnesium(modified Ham Test)(1)
دراين تست از ماده مگنزيم كلرايد mmol/l or 23.7g/l)250 ) استفاده مي شود كاربرد اين ماده باعث افزايش حساسيت عوامل كمپلمان در مكانيسم ليز سلول قرمز مي شود.این روش به مانند روش قبلی انجام می شود با این تفاوت که در همه لوله ها 100 لاندا mgcl2 اضافه می شود . تفسیرآن نیز به مانند تست قبلی می باشد.
برای تهیه کلرید منیزیوم mgcl2 ، 12.7gr از mgcl2 ( وزن مولکولی 203.31 )را در 250cc آب مقطر حل می کنیم.
(2) كومبس مستقيم:
براي تاييد يك تست مثبت، آزمايش كومبس مستقيم انجام مي شود .بنابراین در کلیه مواردی که تست HAM مثبت است یک کومبس مستقیم انجام می شود . در صورتیکه تست کومبس مثبت باشد ، نتیجه مثبت مشاهده شده در تست HAM کاذب بوده و به علت وجود یک آنتی بادی همولیز کننده می باشد . در این گونه موارد فلوسیتومتری (بررسی CD59 ) توصیه می شود و نت زیر گذاشته می شود:
Direct coomb , s test is postlisve and it could be the result of a lytic antibody that has given a false postlisve acidified serum test , so flow cytometry after reaction the red cells with anti-CD59 is recommended if clinically indicated.
CD59(3):
تست CD59 به روش فلوسيتومتري آزمايش تخصصي است كه تاييد كننده بيماري PNH مي باشد.
اقدام بعدی در برخورد با نتایج غیر طبیعی
(تکرار آزمایش –انجام آزمایش تاییدی و تکمیلی- اطلاع سریع به پزشک معالج):
طبق نظر مسئول بخش
مداخله گر ها وواکنش های تداخلی:
PH كمتر از 6.5 يا بيشتر از 7؛استفاده از نمونه كهنه، وجود سلول اسفروسيت؛ وجود بيماري HEMPAS؛دريافت خون به تازگي؛وجود lytic antibody
نکات ایمني:به دستورالعمل حفاظت وايمني در زمان كار با نمونه هاي آزمايشگاه مراجعه شود.
منابع:
Twenty-first Edition of henry´s
Dacie Lewis , Tenth Edition 2006
Laboratory Techniques in hematology, Renu saxena , first edition, 2008
.
دیدگاه خود را درج کنید