HLA typing
عنوان: آزمایش
موارد کاربرد تست:
اسپوندلیت انکیلوزان-سندرم رایتر-آرتریت روماتوئید-سندرم بهجت-بیماری سلیاک-سندرم شوگرن-میاستنی گراو
اساس روش آزمایش:
بررسي درجه ليز شدن سلولهاي لنفوسيت به روش ميكروسيتوتوكسيتي
نمونه مورد نیاز دربخش نمونه گیری:
6cc خون هپارينه
نوع نمونه مورد نیاز دربخش فنی:
6cc خون هپارینه
حداقل مقدار:
2.5cc
ظرف:
لوله پلاستیکی با درب سبز رنگ محتوی ضد انعقادهپارین
معيار غير قابل قبول بودن نمونه
در صورتیکه حجم نمونه کمتر از 2.5ccباشد ونمونه در لوله هایی با ضد انعقادغیر از هپارین گرفته شده باشدنمونه قابل قبول نمی باشد.
مواد و وسايل مصرفي مورد نياز:
سانتريفوژ – ميكروسكوپ – مواد مصرفي شامل فایکول-محلول هنکس-محلول PBS-لام نئوبار-لامل سنگی -سمپلر10 لاندا
پروسه انجام آزمايش:
1. براي هر بيمار 3 لوله در نظر گرفته و شماره گذاري شود .
2. 5cc محلول هنگس در لوله اول ريخته و 2.5cc خون به آن اضافه نمائيد .
3. در لوله دوم 2.5cc فايكول مي ريزيم.
توجه : پس از استفاده از فايكول سريعاً به يخچال برگردانده شود .
4. رقت تهيه شده در لوله اول را به ارامي روي فايكول اضافه مي كنيم به صورتي كه تشكيل فاز گردد .
5. لوله دوم را داخل سانتريفوژ قرار داده به مدت 15 دقيقه در دور 2700 سانتريفوژ مي كنيم ( در اين مرحله تشكيل يك بافي كوت مي گردد كه لنفوسيت ها هستند )
6. لايه نازك بافي كوت را كه دقيقاً در مرز بين فايكول و هنگس مي باشد به ارامي به طور كامل برداشت كرده و داخل لوله شماره 3 منتقل مي كنيم .
7. 5cc PBSبه بافي كوت لوله شماره 3 اضافه مي نمائيم و به مدت 5 دقيقه در دور 1000 سانتريفوژ مي كنيم
8. محتویات لوله را خالی کرده ومجددا5cc PBSاضافه کرده و به مدت 5دقیقه در دور 500سانتریفوژمی کنیم
9. محتويات لوله شماره 3 را خالي كرده و از باقي مانده ان در ته لوله که همان لنفوسیتها می باشد جهت ادامه آزمايش استفاده مي كنيم .
10. بعد از شمارش لنفوسیتها توسط لام نئوبار(رجوع شود به قسمت کالیبراسیون) با استفاده از سرنگ هامیلتون تک شاخه در هر ول یک پوش معادل یک لاندا سلول اضافه می کنیم
11. پلیت زدن:
الگوی D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
– B5,35 B51 B5 B5 B8 B8 B7,27 B27 B27 Con- Con + A
B
C
D
E
F
الگوی ارائه شده الگوی Dمی باشد ر صورتیکه الگو ی مورد نظر Zبود در ستون شماره 3آنتی سرم B5,35 کد شده است و ستون شماره 2خالی می باشد
توجه : طبق الگوي ارائه شده شماره 12 مربوط به كنترل مثبت است و شماره11 مربوط به کنترل منفی می باشد لذا الزامي است كه پليت زني از خانه شماره 11 شروع شود
1. با استفاده از سرنگ هاميلتون 50 يك پوش معادل يك لاندا از لنفوسيت هاي تهيه شده را به ول هاي پليت كه قبلاً يك لاندا از انتي سرم هاي مختلف در ان كوت شده اضافه مي نمائيم .
2. پليت را به مدت نيم ساعت در دماي اتاق انكوبه نمائيد .
3. پس از 30 دقيقه به هر ول با استفاده از سرنگ هاميلتون 250 يك پوش معادل 5 لاندا كمپلمان خرگوش اضافه مي نمائيم . ( توجه نمائيد چنانچه كمپلمان بصورت ليوفليزه باشد با 1 سي سي اب مقطر مخلوط گردد و در حجم هاي مناسب تقسيم شده در جاي مخصوص در فربز قرار گيرد .)
4. مدت 5/1 ساعت پليت را در دماي اتاق انكوبه نمائيد .
5. رنگ ائوزين به صورت اماده بود كه مستقيماً استفاده شود( در غير اين صورت رنگ ائوزين را به نسبت 5 گرم در 100cc هنگس تهيه كرد ) با استفاده از سرنگ هميلتون 50 ، دو پوش معادل 2 لاندا در چاهك ها خالي شود .
6. 5دقيقه پليت ها را در دماي اتاق انكوبه كنيد .
7. محلول فرمالين تهيه شده (2 سي سي فرمالين +1 سي سي هنگس را با هم مخلوط كرده و PH را با NaOH به 2/7 الي 4/7 مي رسانيم ) را به چاهك ها اضافه مي كنيم با سرنگ 250 هميلتون دو پوش معادل 10 لاندا در چاهكها خالي كنيد .
8. پس از 3 ساعت انكوبيشن در دماي اتاق پليت قابل خواندن است . در غير اين صورت پليت را در يخچال تا فردا صبح قرار مي دهيم .
توجه :
1. در تمام مراحل پليت زني درب پليت نبايد بيش از اندازه باز بماند .
2. پليت را در جاي مناسب در يخچال قرار دهيد تا از تكان هاي احتمالي در امان باشد .
3. تمام محلول هاي استفاده شده 4/7 – 2/7=PH داشته باشند .
4. در اين تست نبايد آب وارد شود در نتيجه از خشك بودن كامل لوله مطمئن شويد .
خوانش پليت :
براساس درصد ليز شدن لنفوسيتها بوسيله ميكروسكوپ نوري با لنز 10 خوانده مي شود
روش کالیبراسیون:
منطقه RBC در لام نئوبار يك مربع 25 خانه است كه هر خانه آن به 16 قسمت تقسيم شده. جهت كاليبراسيون از يك خانه 16 تايي استفاده مي شود . با استفاده از سمپلر 10 لاندا از لنفوسيتها برادشت كرده بين لامل سنگي و لام نئوبار خالي كنيد .
در قسمت مربوط به شمارش RBC در يك خانه 16 تايي بايد تعداد 14 الي 18 عدد سلول لنفوسيت شمارش شود . اگر تمام مراحل تا اين مرحله بدرستي انجام شده باشد پلاكت و گلبول قرمز در لام مشاهده نمي شود در غير اين صورت مرحله 7 را انجام دهيد .
در صورتي كه تعداد لنفوسيتها 14 الي 18 عدد نبود:
1. اگر لنفوسيت زياد بود با هنگس رقيق شود ( معمولاً 50 الي 100 لاندا كافي است )
2. اگر لنفوسيت كم بود از باقي كوت برداشت كرده و مراحل 6 و7و 8 دوباره تكرار شود .
توجه : منطقه RBC در لام نئوبار يك مربع 25 خانه است كه هر خانه آن به 16 قسمت تقسيم شده . جهت كاليبراسيون از يك خانه 16 تايي استفاده مي شود
كنترل كيفيت انجام آزمايش:
استفاده از کنترل مثبت و منفی برای هر بیمار
نحوه محاسبه نتيجه به روش كمي:
Lymphocyte microcytotoxicity Assay
Strong positive =VIIIgraded (81%or greater lysis )
positive =VI greded(51% to 80% lysis )
Weakpositive = IV greded (21% to 50% lysis )
Questionably positive= IIgraded (11%to 20% lysis )
Negative =I greded (less than 10% lysis )
چگونگی تفسیر نتایج:
اسپوندلیت انکیلوزان-سندرم رایتر-آرتریت روماتوئید- HLA -B27
سندرم بهجت HLA- B5
ماتیپل اسکلروزیس -هموکروماتوز با علت نا معلوم HLA- B7
بیماری سلیاک-سندرم شوگرن-بیماری گریوز -دیابت قندی جوانان-میاستنی گراو HLA- B8
اقدام بعدي در برخورد با نتايج غير طبيعي:
در صورت لزوم نمونه تکرار می شود
نكات ايمني:
رعايت نكات ايمني در هنگام تماس با نمونه خون آلوده به ويروسهاي HBV وHBS
منابع:
Clinical Diagnosis and management by laboratory methods (henry )
19EDITION pag 970 chapter 37
دیدگاه خود را درج کنید