Hemoglobin A2
1- هدف
هدف از تدوين اين دستورالعمل، تشريح روند انجام آزمایش A2 می باشد.
2 – دامنه کاربرد
اين دستورالعمل در واحد هماتولوژی برای انجام آزمایش A2 بر روی نمونه های خون تام EDTA كاربرد دارد.
3 – مسئولیت اجراء
مسئوليت نظارت بر اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول کنترل کیفیت و سوپروایزر می باشد.
مسئوليت اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول واحد هماتولوژی می باشد.
4 – تعاریف
بررسی کم خونی میکروسیتیک از جهت هموگلوبینوپاتی ها به خصوص تالاسمی و بویژه بتا تالاسمی مینور.
• عنوان آزمایش
Hemoglobin A2
• اصول انجام آزمایش
اساس این آزمایش مبتنی بر کروماتوگرافی ستونی است. در شرایط قلیایی هموگلوبین دارای بار منفی است و به رزین دارای بار مثبت می چسبد لذا با استفاده از معرف اختصاصی هموگلوبین A2 از رزین جدا شده و با اسپکتروفتومتر در طول موج 415 نانومتر اندازه گیری می شود.
5- شرایط نمونه :
• حداقل مقدار نمونه :
100 لاندا
• نوع نمونه :
خون تام EDTA
• شرایط نمونه برداری :
ناشتایی ضرورتی ندارد
• شرایط نگهداری و پایداری:
معرف های 1 و 2 فقط برای همان کیت قابل استفاده است. لذا از مخلوط کردن معرف های سری ساخت متفاوت خودداری نمائید.
معرف شماره 1 حاوی سیانور پتاسیم است. شرایط ایمنی رعایت شود.
اگر میزان هموگلوبین بیمار کمتر از 7gr/dl باشد، از 50 لاندا خون Packed cell جهت تهیه همولیزانت می توان استفاده نمود. این کیت ترجیحا در دمای 8-2 درجه سانتی گراد نگهداری شود و قبل از استفاده از کیت حداقل نیم ساعت در دمای 25-18 درجه سانتی گراد قرار گیرد. عدم رعایت این مطلب باعث افزایش کاذب A2 می شود.
پایداری نمونه بمدت حداکثر یک هفته در 8-2 درجه سانتی گراد
• شرایط رد یا قبول نمونه :
نمونه لخته – عدم بر چسب مشخصات نمونه – همولیز بودن نمونه
6- مواد ، لوازم و تجهیزات
کیت مورد مصرف آزمایش – سمپلر – سرسمپلر – اسپکتروفتومتر با طول موج 415 – لوله آزمایش شیشه ای و پلاستیکی – جا لوله ای
7-روش انجام آزمایش:
1- تهیه همولیزیت :
در یک لوله پلاستیک یکبار مصرف 600 لاندا (6/0 میلی متر) معرف شماره 2 یا همولیزانت ریخته و به آن 100 لاندا (1/0 میلی لیتر) خون تام مورد آزمایش اضافه نموده خوب تکان دهید، 5 دقیقه صبر کنید تا کاملا همولیز شود.
2- آماده نمودن ستون :
ابتدا درب پیچ دار ستون را باز نموده و با سوآب پلاستیکی همراه کیت ژل داخل ستون را بهم بزنید. سپس انتهای ستون را از محل بالای کتابی با فشار مختصری شکسته و صبر کنید تا بافر داخل ستون خارج شود و آن را دور بریزید.
3- جدا سازی A2 :
100 لاندا از محلول همولیزیت برداشته و به آرامی روی ژل بدون اینکه به جدار ستون تماس داشته باشد بریزید. 5 دقیقه صبر کنید تا خون جذب ژل شود. ستون را روی لوله آزمایش بلند و کاملا تمیز قرار داده و 3 میلی لیتر معرف شماره 1 با سمپلر و سرسمپلر یکبار مصرف بریزید و محلول صاف شده را جمع نمائید. لطفا از پیپت برای ریختن محلول شماره یک استفاده ننمائید.
4- تهیه استاندارد (توتال) :
به یک لوله آزمایش 160 × 16 مقدار 9/14 میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر (دیونیزه) اضافه نموده، سپس 100 لاندا محلول همولیزیت افزوده و خوب تکان دهید. برای هر بیمار یک تست توتال از همان خون همولیزیت خود بیمار تهیه شود.
5 – محاسبه :
OD محلول A2 و OD توتال را در مقابل بلانک (آب مقطر) در طول موج 415 نانومتر قرائت کرده و به شرح زیر محاسبه کنید.
OD Test را تقسیم بر OD Total کرده ، نتیجه را ضرب در 20 کنید و بدین صورت مقدار درصد هموگلوبولین A2 بیمار را محاسبه کنید.
8- کنترل کیفیت :
1) بررسی شرایط اجرایی آزمایشات الکتروفورز شامل (A، F و 2A) لزوم کنترل موارد ذیل را الزامی می نماید:
1- کیت الکتروفورز
2- نرم افزار و پرسنل
1-1) برای کنترل کیفی کیت الکتروفورز، مقرر شد روال ذیل اجرا شود:
1- تهیه محلول کنترلی همولیزانت به حجم تقریبی بیش از 3 سی سی (mL)
2- تقسیم محلول کنترلی همولیزانت ساخت شده در میکروکاپ ها با حجم 40 لاندا
3- تهیه نمودار مبنا بر اساس خوانش 20 کنترل همولیزانت
4- خوانش کنترل همولیزانت در هر ران آزمایش الکتروفورز
5- ورود اطلاعات کنترل در نرم افزار کنترل کیفیت جهت تهیه نمودار در همان روز
6- بررسی قوانین وستگارد جهت تحلیل نمودار
2-1) با توجه به قابل تغیر بودن اسکن نرم افزار الکتروفورز و لزوم کنترل یکنواختی و ثبات
مراحل آزمایش: باید روال ذیل انجام شود:
1- باید تمامی نمونه های غیر طبیعی آزمایشات الکتروفورز به همراه مشخصات و نتایج مرتبط در واحد هماتولوژی به مدت حداقل 3 ماه نگهداری شود.
3- بررسی نتیجه فعلی نمونه با نتیجه قبلی آن و صحه گذاری آن توسط مسئول فنی
4- بایگانی مناسب نتایج کنترل نمونه های غیر طبیعی در زونکن کنترل کیفیت آزمایشات الکتروفورز
2) بر اساس الزام فنی و کنترلی جهت صحه گذاری نتایج غیر طبیعی آزمایشات الکتروفورز باید به شرح ذیل اقدام لازم انجام شود:
1- برای آزمایش هموگلوبین A2 :
1-1- در صورتیکه مقدار MCV نمونه کمتر از 80 باشد و نسبت MCV/RBC نیز کمتر از 5/13 باشد. باید نمونه با روش ستونی نیز آزمایش شود.
2-1- نتیجه آزمون ستونی باید در نتیجه الکتروفورز قید شود و توسط مسئول فنی صحه گذاری گردد.
2- برای آزمایش هموگلوبین F:
1-2- در صورتیکه نتیجه آزمایش هموگلوبین الکتروفورز F بالا باشد، باید نمونه مذکور به همراه یک نمونه نرمال تحت آزمایش دستی قرار گیرند.
2-2- نتیجه آزمون دستی باید در نتیجه الکتروفورز قید شود و توسط مسئول فنی صحه گذاری گردد.
9- نحوه محاسبه نتایج در روش های کمی :
میزان درصد هموگلوبین A2 نمونه از فرمول عمومی زیر محاسبه میگردد .
× VHbA2 100 AHbA2
Hb A2% = —– × —————————
AHb Tota1× VHb Tota1 Rec
حجم Hb A2 (VHbA2) 3میلی لیتر، حجم توتال هموگلوبین(VHb Total)
12 میلی لیتر، میانگین بازیافت (Recovery mean) 82/0
از فرمول مختصر شده زیر جهت درصد هموگلوبین A2 استفاده گردد .
جذب نوری Hb A2
30.5=% HbA2 ×——————-
جذب نوری Hb Total
10- محدوده مرجع (Reference Interval) :
افراد سالم 3.5 – 1.5 درصد – بتاتالاسمی هتروزیگوت 10 – 3.6 درصد
توجه : هموگلوبین های D – G – E – O – C همراه با A2 از ژل عبور می نمایند. توصیه می شود افزایش بیش از 6 درصد با الکتروفورز تایید شود.
11- محدوده قابل اندازه گیری Reportable Range :
5/3 – 5/1
12- محدوده هشدار یا مقادیر بحرانی :
ندارد
• • ملاحظات ایمنی:
در هنگام کار با نمونه حتما از دستکش استفاده شود و پس از پایان کار سطوح کاری با محلول تمیز شود.
13- ویژگی های آنالیتیک (خصوصیات و کارآیی آزمایش):
ندارد
14- محدودیت های انجام آزمایش (منابع بالقوه تغییر پذیری) :
ندارد
15- اقدامات بعدی دربرخورد با نتایج غیر طبیعی :
ندارد
16- عوامل مداخله گر :
هموگلوبین S و هموگلوبین F هیچ تداخلی در این روش ندارند.
بیلیروبین تا 20 mg/dl و تری گلیسیرید تا 1000 mg /dl تداخل ندارد، برخی داروها و مواد ممکن است تداخل داشته باشند.
نکته 1 : نگهداری طولانی مدت ستون ها گاهی اوقات باعث فشردگی رزین و کندی عبور محلول می گردد. پیشنهاد می گردد در اینگونه موارد به مدت 10 دقیقه ستون را معکوس قرار داده و سپس به حالت اول برگرداند و بعد از جایگزین شدن ستون پایین آن را قطع نمائید.
نکته 2 : وجود حباب هوا در داخل رزین هیچگونه تداخلی در آزمایش ندارد.
نکته 3 : کیتها حتماً در حرارت C ْ30-15 نگهداری شوند، در غیر اینصورت جوابها غیر قابل اطمینان می باشند.
نکته 4 : نگهداری نمونه بیش از 8 روز و یا در شرایط غیر از C ْ 8-2 موجب ایجاد جواب کاذب می گردد.
نکته 5 : وجود کدورت و مواد خارجی در محلول نشانه خرابی است.
نکته 6 : عدم وجود بافر در بستر رزین و یا زرد شدن نشانه خرابی ستون است.
• تداخلات دارویی :
ندارد
17- چگونگی تفسیر نتایج :
هموگلوبین A2 در بتا تالاسمی مینور افزایش می یابد که در این شرایط به ندرت بیش از 7% می باشد. در صورت فقر آهن همزمان سطح هموگلوبین A2 پایین خواهد بود. هموگلوبین A2در پرکاری تیروئید و کم خونی مگالوبلاستیک و کم خونی داسی نیز افزایش می یابد (حداکثر تا 4.5%)
• موارد افزایش:
بتاتالاسمی مینور – پر کاری تیروئید – کم خونی
• موارد کاهش:
فقر آهن
18- سایر موارد :
ندارد
19- مدارک مرتبط
ندارد
20 – مراجع و ضمائم
1) بروشور کیت
2) کتاب Pagana
دیدگاه خود را درج کنید