اشکال مختلف ژن آّپولیپو پروتئینC3 در بیماری کبد چربی دار غیر الکلی

آزمایشگاه پاتوبیولوژی سپند

عناوین

از سال 2004 تا سال 2009 مردانی از هند و آسیا که سالم بودند.سیگار نمی کشیدند و دارای وزن نرمال بودند را به خدمت گرفتیم.این کاندیدها توسط اعلان آگهی و به صورت تصادفی انتخاب شدند و فرمهای مخصوصی توسط این افراد و اطلاعاتی که برای هر موضوع داده اند تکمیل شد و پروتکل ها توسط کمیته موضوعات انسانی در دانشگاه YALE مورد بررسی و تصویب قرار گرفت.

شرکت کنندگان به سوالاتی درباره رژیم غذایی روزانه،میزان نوشیدنی الکل دار و هرگونه تغییری که در وزن بدن و عادت غذایی خود در 12ماه گذشته داشته اند پاسخ دادند.همچنین از آنها خواسته شد که غذا و پیش غذاهایی که در روز مصرف میکنند را توصیف کنند.ترکیب هر رژیم شرکت کننده قبل از آنکه دیده شود مورد سنجش قرار گرفت.فعالیت های فیزیکی(کار روزانه،زمان فراغتو ورزش) توسط میانگین دستگاه مسافت سنج و پرسشنامه مورد بررسی قرار گرفت.

اندازه گیری گلوکز پلاسمای خون،انسولین و لیپید:

غلظت گلوکز ناشتا پلاسما با استفاده از دستگاه تجزیه بیوشیمی YSI STAT2700مورد سنجش قرار گرفت. غلظت انسولین ناشتا پلاسما با استفاده از کیت اندازه گیری آنتی بادی رادیوایمونولوژی مورد بررسی قرار گرفت.تری گلیسرید پلاسمای ناشتا،کلسترول کل،لیپو پروتئین با چگالی پایین( LDL )،کلسترولو غلظت آپولی پروتئین نیز بطور آنزیمی مورد بررسی قرار گرفت.

غربال ژنتیکی:

DNA ژنومی از خون استخراج شدو شرکتکنندگان بر اساس باند مولکولیSNP به دو گروه RS2854116وrs2854117 تقسیم بندی شدند.(برای جزییات بیشتر ضمایم و اصطلاحات ضمیمه ببینید و همچنین مقاله کامل را میتوانید در سایتnejm.org ببینید).اینSNP ها نشان دادند که با تری گلیسیرید بالا همبستگی دارند.مطالعات قبلی نشان میدهد که نشانگر RS651821 در ژنAPOC3 با لیپید بالا همبستگی دارد و ما ممانعت کردیم از افرادی که مشخص شده بود دارای تنوع ریسکی بالایی برای تنوع مولکولی بودند و افرادی که برای تنوع ژن APOC3 هموزیگوت بودند.بعلاوه ما همه شرکت کنندگان را برای نشانگر RS7384 در ژن PNPLA3 تقسیم ژنوتیپی کردیم که مطالعات نشان داده بودند که با افزایش محتوی تری گلیسیرید همراه بوده اند.

طبقه بندی ژنتیکی:

2 نشانگرSNP در ژن APOC3 در منطقه شروع کننده PROMOTOR که در بالا دست منطقه ی رونویسی وجود دارند واقع شده بودند و دارای پیوستگی خیلی قوی میباشند. آلل های مختلف RS285416و RS285414 هرکدام با افزایش تظاهر ژنAPOC3 در شرایط آزمایشگاه نسبت به آلل های وحشی یا هموزیگوت همراه شده بود. زیرا این همبستگی غیر مستقل است و و افزایشی نیست و به صورت غالب میباشند. ما شرکت کنندگان در این مطالعه را به 2 گروه ژنتیکی معین تقسیم بندی کردیم و هدف از این کار این بود که:

_ افرادی که هموزیگوت بودند(نوع وحشی دارای آلل های یکسان و تظاهر پایین داشتند)

_افرادی که ناقل یک یا بیشتر آلل های گوناگون بودند

اندازه گیری حساسیت به انسولین:

همه افرادی که به انسولین حساسیت دارند توسط آزمایش مقاومت به گلوکز در هر 3 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفتند. یک شربت 75گرمیDEXTROZ (شامل کرتین.ماکسون و گلوکار)مدیریت،و به افراد داده شده بود و نمونه های خون در فواصل زمانی 10 .20 .30 .60 .90. 120. 150 و 180 دقیقه برای تعیین میزان گلوکز پلاسمای خون و غلظت انسولین جمع آوری شد. شاخص حساسیت به انسولین همانند روش توضیح داده شده محاسبه گردید.

اندازه گیری میزان تری گلیسیرید هپاتیک:

میزان تری گلیسیرید هپاتیک توسط سیستم PIO-SPACE4Tاندازه گیری شد.نمونه های گرفته شده از کبد با استفاده از چرخش رادیویی پروتون I(9-13)سانتیمتر اندازه گیری شد.محتوی تری گلیسیرید نیز به وسیله تششعشع پروتئینی اندازه گیری شد. و توسط داخل کبد در 3 جایگاه مختلف برای ارزیابی و محاسبه هتروژنتیکی بافتهای هپاتیکی استفاده گردید.

آزمون مقاومت به چربی:

غلظت تری گلیسیرید پلاسما و میزان جذب استر اسید چرب رتینیل در یک زیر گروه از افراد هندی تبار آسیایی و بعد از اینکه آنها یک وعده غذایی پر چرب مصرف کردند اندازه گیری شد.در دیگر زیر گروه افراد هندی آسیایی تبار،حد مجاز تری گلیسیرید پلاسما در مدت زمان تست مقاومت به چربی درون سیاهرگی اندازه گیری شد(جزییات این روش در بخش ضمایم توصیف شده است).

سنجش استئوسیز هپاتیک با کاهش وزن:

زیر گروهی از افراد تحت آزمون با استئوسیز هپاتیک(محتوی چربی هپاتیک بیشتر از 5.5 درصد)مورد مطالعه قرار گرفتند. بعد از برنامه ریزی جهت محدود کردن کالری غذایی(تقریبا1200 کیلو کالری در هر روز)و بعد از صبحانه،وزن افرادريالگلوکز پلاسما،غلظت انسولین و میزان تری گلیسیرید کبد در یک هفته اندازه گیری شد.برنامه های کاهش وزن تا زمانیکه سطح تری گلیسیرید هپاتیک نرمال شد ادامه داشت.دوره ی کاهش کالری مصرفی ادامه داشت به وسیله 4 هفته پایداری وزن تا زمانیکه رژیم تعادل کالری حاصل شد(35 کیلو کالری در هر کیلوگرمِ وزن افراد،60 درصد کربوهیدرات،20 درصد پروتیین و 20 درصد چربی).

مطالعات تاییدی بر روی افراد غیر هندی آسیایی تبار:

برای آزمودن ارتباط بین تنوع مولکولی در ژن(APOG3)و استیوسیز هپاتیک،ما یکسری مطالعات تکمیلی را در مردان غیر آسیایی تبار که تندرست و عدم مصرف لیگاز داشتند به طور تصادفی انجام دادیم.افراد مورد بررسی توسط آگهی های مکانی انتخاب شدندو با استفاده از معیار های محدودیتی و گستردگی که برای افراد آسیایی تبار به کار رفته بود مورد ارزیابی قرار گرفت.

تجزیه^ء آماری:

غلظت تری گلیسیرید کبد و پلاسما توسط تبدیل داده ها به توزیع نرمال تبدیل شدند و توسط استفاده از آزمون کولموگروف سیمرنف(آزمون نرمالیتی)مورد سنجش قرار گرفت.میزان تری گلیسیرید کبد به صورت لگاریتم در پایه 10، تری گلیسیرید پلاسما به صورت لگاریتم طبیعی و سطوح آپولی پروتئین c3 در پلاسما تصحیح شدند.بر اساس سن و شاخص میزان وزن بوسیله ی میانگین دگرسیون خطی برای سنجش میزان همبستگی مدل های افزایش دو مدل مورد استفاده قرار گرفت . آزمون دگرسیون خطی برای همبستگی با ژنوتیپ های hs 2854116 و hs 2854117 ( ژنوتیپ هایی که هر کدام از ژن 4np آنرا کد می کرد به عنوان 2 یا 7/0 ) و تجزیه واریانس یک طرفه . برای ارزیابی همبستگی مدل های غالب ما از آزمون دگرسیون خطی استفاده کردیم ، برای همبستگی (ژنوتیپ های کد شده به عنوان 0 یا 1 همانند آزمون t غیر جفت شده ) ، آزمون t غیر پارامتریک و تست من و تینمی مورد استفاده قرار گرفت. برای مقایسه میانگین بین افرادی که دارای یک یا بیشتر از یک آلل برای هر یک از ژن هایNP34 APOC داشتند با افرادی که دارای هر دو آلل 4NP بودند ، ( مقایسه بین هتروزیگوت و هموزیگوت ) آزمون t جفت شده برای مقایسه میانگین افراد در قبل از کاهش وزن با همان افراد بعد از کاهش وزن ، همه ی آزمون ها توسط نرم افزار 4 PSS نسخه ی 16 و یا نرم افزار 4 ASاجرا گردید . و از آزمون دو طرفه جهت درصد معنی داری در سطح نیم درصد استفاده گردید . تفاوت در گستردگی بیماری های چربی غیر الکلی کبد در بین افراد مورد مطالعه تعیین شده بود بوسیله ی میانگین آزمون فیستر و میزان پیوستگی نابرابر D با استفاده از جدول محاسبه شود .

نتایج :

افراد و ژنوتیپ­ها :

ما ارزیابی­های اولیه کلینیکی را در افراد آسیایی- هندی تبار اجرا کردیم. هفت نفر دارای تنوع بالائی از RS651821 برای ژن ApoA5 بودند. ویژگی­های کلینیکی 95 نفر که دارای معیارهای مورد نیاز برای این آزمایش بودند در جدول یک نشان داده می­شود. میانگین سن افراد 13 32 سال بود و شاخص وزنی که تقسیم وزن به کیلوگرم بر مربع اندازه فرد بود بوجود آمده بود 6/3 7/24.

10 نفر از افراد (20%) هموزیگوت بودند و 76 نفر حداقل ناقل یکی از آللها بودند و هتروزیگوت بودند تعداد افراد با هر ترکیب ممکنه از هاپلوتیپ و جایگاههای ژنی در جدول یک در قسمت ضمائم مشاهده می­گردد. 76 نفری که ناقل یکی از آلل­ها بودند با توجه به سن، وزن بدن، شاخص وزن بدن و سطح فعالیت فیزیکی شبیه به 19 فردی که دارای آلل­های هموزیگوت هستند، بودند (ببینید ضمائم را در جدول 2). درصد میزان پذیرش کالری روزانه توسط چربی کربوهیدرات و پروتئین در دو گروه یکسان بودند.

چربی پلاسما، محتوی چربی هپاتیک و مقاومت انسولین :

غلظت آپولی پروتئین C3 در پلاسما در افرادی که ناقل یکی از آلل­ها بودند تقریباً 30 درصد بیشتر بود نسبت به افرادی که دارای آلل­های هموزیگوت بودند. (جدول دو). بعلاوه، غلظت تری گلسیریدپلاسمای ناشتا، در افراد حامل­ آلل­های هتروزیگوت تقریباً 60 درصد بیشتر بود. اختلاف معنی داری بین دو گروه از لحاظ غلظت کل کلسترول پلاسما و کلسترول HDL و کلسترول LDL مشاهده نگردید.

متوسط میزان تری گلیسرید هپاتیک در افرادی که دارای آللهای مختلف ApoG3 بودند بیشتر از افراد هموزیگوت می­باشد. (میانگین 3/10 5/7 درصد، میانه 2/3 درصد برای افراد هتروزیگوت و میانگین 3/1 5/1درصد و میانه 1/1 درصد برای افراد هتروزیگوت، P<0.001) (شکل 1.A). این اختلافات باقی مانده­اند وقتی که تجزیه توسط سن و شاخص وزنی (005/0= P بوسیله آزمونt استیودنت و 02/0= P برای آزمون من و تینی) تصحیح شده بود.

میزان گستردگی بیماری چربی غیرالکلی کبد (محتوی لپید هپانیک بیشتر از 5/5 درصد) در بین افراد حامل برابر 38 درصد بود و هیچکدام از افراد هموزیگوت بیماری چربی غیرالکلی کبد را نداشتند (001/20P) (شکل A10). افرادی که دارای بیماری چربی غیرالکلی کبد را داشتند با افرادی که فاقد این بیماری بودند از لحاظ مقاومت انسولین مقایسه شدند (شاخص حساسیت با انسولین 2 /2 در افراد بیمار و در افراد غیربیمار 6/1 5/3)

تری گلیسرید پلاسما و غلظت اسید چرب رتینیل

از 28 نفر حامل آلل­های ژنی Apoc3 و 10 نفر دارای آلل هموزیگوت وحشی، آزمون مقاومت به چربی زبانی گرفته شد. میانگین سطح زیرمنحنی (Auc) برای غلظت تری گلیسرید پلاسما تقریباً در گروه حامل آلل ژن دو برابر افراد هموزیگوت آلل وحشی بود (102 746 در مقابل 41 383 میلی گرم 002/0= P) (شکل A2) و بطور مشابه در میان افراد حامل آلل­های مختلف، تغییرات Auc برای غلظت پلاسمای 1 لیتر اسید چرب رتینیل تقریباً دو برابر افراد نوع وحشی آلل یا هموزیگوت بود (36 60 در مقابل 19 36 میکرومول در هر لیتر در هر ساعت 01/0=P) (شکل 2-B)

حد مجاز تری گلیسرید پلاسما :

15 نفر از افراد حامل آللهای مختلف و 4 نفر از نوع هموزیگوت آزمون مقاومت به چربی به شیوه درون سیاهرگی گرفته شد افراد آللهای مختلف هتروز یگوت دارای 46% افزایش در سطح زیر منحنی برای نسبت غلظت تری گلیسرید پلاسما بودند که نشان دهنده حد مجاز تری گلیسرید پلاسما در مقابل افراد هموزیگوت بودند(21+171 در مقابل 71+249)درصد در هر ساعت 46%p=) (شکل 3)

اثر کاهش وزن برروی استئوسیز و مقاومت به انسولین

هفت نفر با استئوسیز و مقاومت به انسولین خواسته شد تا رژیم کالری خود را کاهش داده اند ، در یک دوره 3تا6 ماهه میانگین وزن انها کاهش یافت از N10+4/80 کیلوگرم به 7/10+4/80 کیلوگرم(003/0=p) این کاهش وزن همراه با کاهش میزان تری گلیسرید کبد از 14 به 8/3 درصد در سطح خطا 50/0درصد بود بعد از کاهش وزن در حساسیت به انسولین در گلوکز پلاسما و غلظت انسولین پلاسمایکبهبودمشاهده شد (شکل 1در ضمائم ) وافزایش در شاخص حساسیت به انسولین (از8/0+8/1به 4/1+7/3 با سطح خطا 01/0>p)

اثرژنوتیپ PNPLA3 بر روی استئوسیزهپاتیک

محتوی تری گلیسرید کبد همچنین افزایش یافته بود در افرادی از ژنوتیپ GGوCG با آلل RS738409 در PNPLA3که مقایسه شده است با افرادی با ژنوتیپ CC ، با استفاده از مدل غالبیت (002/0=p به وسیله آزمون tاستیودنت 003/0=pبه وسیله آزمون رگرسیون خطی)ومدل افزایش (008/0=p به وسیله تجزیه واریانس و 04/0=p به وسیله رگرسیون خطی ).تنوع در Apoc3 به تنهایی ،pnplA3 به تنهایی و دو نوع ترکیب شده به ترتیب شامل 11،5/6،1/13 درصد از واریانس در بیماری چربی غیر الکلی کبدی شده بود .

مطالعات تاییدی در مردان غیر آسیایی –غیر هندی تبار

مطالعات تاییدی برای 163 مرد تندرست غیر آسیایی –هندی تبار (108نفر سفید پوست ، 26آسیایی ، 14سیاه پوست و 15 نفر اسپانیایی مقاوم (جدول ا و جدول 2 در بخش ضمائم ).گستردگی بیماری چربی غیر الکلی کبد در افراد حامل آللهای مختلف و APOC3نسبت به افراد هموزیگوت بیشتر بود همانند بررسی صورت گرفته در افراد هندی – اسیایی تبار(9درصد در مقابل صفر در صد و 20/0= P) (در شکل1B) به طور مشابه مردان غیر هندی – آسیایی تبار با بیماری چربی غیر الکلی کبد مقاوم با انسولین بودند و شاخص حساسیت به انسولین در مقایسه با افراد غیر آسیایی بدون بیماری چربی غیر الکلی کبد در آنها پایین بود (1+92/2 در مقابل 2/2+93/4 ،01/0=p)

بحث و نتیجه گیری

ما ارتباط بین تنوع ژنتیکی درژنApoc3 و میزان ابتلا به بیماری چربی غیر الکلی و مقاومت به انسولین را مطالعه کردیم .

تنوع ژن Apoc3 مورد مطالعه قرار گرفت (T-455CوC-482T) با تقریبا افزایش 30 درصدی در غلظت آپولی پروتئین c3 در پلاسما ناشتا همراه شده بود، و تقریباً افزایش 60 درصدی در غلظت تری گلیسرید پلاسما ناشتا و افزایش تقریبی فاکتور دو درتریگلیسریدی پلاسما و غلظت استراسید چرب رتینیل بعد از تست های مقاوم به چربی همراه شده بود، 38درصد ازمردان آسیایی – هندی تبار با ژن Apoc3 دارای بیماری چربی غیرالکلی کبد و مقاومت نشان دار به انسولین بودند و افراد فاقد ژن Apoc3 که دارای ژن هموزیگوت وحشی بودند ، این بیماری را نداشتند.این همبستگی در یک گروه مستقل از افراد غیر آسیایی –غیر هندی تبار نیز تایید شده بود.

همچنین ما میزان غلظت تری گلیسرید پلاسما را بعد از تزریق لیپید درون سیاهرگی اندازه گرفتیم ویافتیم که کاهش 46 درصدی در حد مجاز تری گلیسرید پلاسما در افراد حامل Apoc3 در مقایسه با افراد هموزیگوت وجود دارد . این یافته ها کمک کرد که این فرضیه را داشته باشیم که آللهای مختلف Apoc3 افزایش دهنده و سرعت دهنده تری گلیسسرید بالا به وسیله کاهش حد مجازی تری گلیسرید می باشند . این داده ها با نتایج حاصل از مطالعات قبل که در موش های ترانسژنیک آزمایش شده بود دارای مطابقت بود. به همین ترتیب مطالعات اخیر بوسیله pollin و همکاران نشان داد که جهشهای متفاوت درژن c3 آپولیپوپروتئون سبب کاهش سطح تری گلیسرید پلاسما گردیده است و دارای اثرات محافظت کننده در افراد amish می باشد .

روی هم رفته این نتایج پیشنهاد کرد که اشکال مختلف Apoc3 شامل c-482t و

t-455c منجر به افزایش غلظت آپولیپوپروتئین C3 در پلاسما شده است که سبب فعالیت لیپازپروتئین و حد مجازتری گلیسرید می گردد . غلظت ذرات کیلو میکرون معلق افزایش یافته است .که توسط کبد توسط مراحل پذیرنده حرکت می کند .

شواهد قوی نشان داد که بیماری چربی غیر الکلی کبد نقش مهمی درمقاومت انسولین هپاتیک دارد. مطالعات اخیر نشان داده است که غلظت دیاسیل گلیسرول افزایش یافته در سلولهای هیپاتیکی منجر به فعالیت لیپاز پروتئین نوع cو در نتیجه کاهش انتقال انسولین و مقاومت به انسولین هپاتیکی شده است .

به علاوه چرخش معکوس بیماری چربی غیر الکلی کبد به وسیله کاهش وزن متعادل مقاومت به انسولین هپاتیک را منجر گردیده و سرعت می بخشد ، افزایش گلایسمیا را در بیماران نوع دو دیابت .

با مطالعات تکمیلی ما دریافتیم که متعادل کردن کاهش وزن (تقریباً به میزان 6 کیلوگرم )در افراد آسیایی – هندی تبار سبب حذف استئوسیزهپاتیک و بهبود حساسیت بدن به انسولین به عنوان منعکس کننده کاهش گلوگز پلاسما و غلظت انسولین و افزایش شاخص حساسیت به انسولین گردیده است .

ما فهمیدیم که گستردگی الل های مختلف ژن Apoc3 در میان مردان آسیایی –هندی تبار و مردان غیر آسیایی –غیر هندی به طور مشابه است ما پیشنهاد کردیم که فاکتوهای دیگری که سبب افزایش بیماری در بین افراد آسیایی – هندی تبار میشود را مورد توجه قرار دهیم ،به همین ترتیب ما همچنین براساس تنوع مارکری snp rs73849 درژن pnpla3 مردان آسیایی هندی تبار را گروهبندی ژنوتیپی کردیم که نتایج نشان داد این باند با بیماری چربی غیر الکلی کبد دارای همراهی و همبستگی میباشد که علت آن ناشناخته است ما فهمیدیم که ژنوتیپ های GG و CG حاصل از این SNp با افزایش تری گلیسرید در مقایسه با ژنوتیپ های CC همبستگی بالائی دارد .

ما همچنین کسری ازواریانس ایجاد شده توسط ژنهایAPOC3 و PNPLA3 و و یا هردو آنها در ایجاد بیماری چربی غیرالکلی کبد آزمایش کردیم که به ترتیب شامل 11،6.5 و13.1 درصد از واریانس مجموع میباشد.همچنین به نظر میرسد این ژنها دارای اثرات متقابل متقابل نسبت به باشند.با این وجود به نظرمیرسد اشکال مختلف PNPLA3 برخلاف APOC3 فاقد همبستگی با مقاومت به انسلولین باشند.بطور خلاصه ما دریافتیم که تنوع ژن APOC3 با ایجاد بیماری غیر الکلی کبد و مقاومت به انسولین در شاخه های از مردان آسیایی-هندی تبار همبستگی دارد. ما این نتایج را در شاخه ای دیگر از افراد غیر آسیایی-هندی تبار نیز ملاحظه و به تائید رساندیم.