117OHP هیدروکسی پروژسترون
4- تعاریف
عنوان:
17 آلفا هیدروکسی پروژسترون 17αm OH_ progesterone این هورمون متابولیت 17 پروژسترون مترشحه از کورتکس آدرنال و گونادها ست. اندازه گیری این هورمون در بررسی هیپرپلازی مادرزادی آدرنال CAH ارزش تشخیصی دارد. این نقص شایع مادرزادی که در اثر کمبود آنزیم C21-Hydroxy lase ایجاد می شود نیاز به درمان با استروئید ها را ایجاب می کند.کارایی درمان با اندازه گیری مستمر 17 OHP خون انجام می شود.
شیوع این بیماری در نوزاد و در آلاسکا نوزاد است. تشخیص سریع آن در نوزاد مبتلا در علت یابی بحران افزایش یافته متابولیت آدرنال و بزرگی آلت تناسلی بکار می رود.
در مقابل عدم تشخیص بموقع منجر به پرموئی Virilization و سایر علائم ثانویه جنسی در کودک دختر و بروز زودرس این علائم در کودک پسر می شود.
تشخیص و درمان بموقع این عارضه باعث رشد و نمو طبیعی کودک خواهد بود. مکانیزم افزایش
17 oHP در هیپرپلازی آدرنال بدینصورت است که
11- OH-Prog ——-> CPs ——-> Cortisol
17 پروژسترون پیش ساز هورمون 11- دزوکسی کورتیزول CPs و آن نیز پیش ساز کورتیزون است. این تبدیلات در اثر فعالیت 21 هیدروکسیلاز صورت می گیرد. در صورت کمبود یا نقص عملکرد 21 هیدورکسیلاز تعداد 17P بالا می رود لذا اندازه گیری آن یک اندیکاتور غیر مستقیم از کمبود 21 هیدروکسیلاز است. چون کورتیزول نیز بمقدار کافی ساخته نمی شود فید بک ایجاد نشده و ACTH بالا می رود که آن هم باعث آسیب هیپرپلازی آدرنال می شود. افزایش غلظت 17P یا 17OHP خون نشانه هیپرپلازی آدرنال است.
اصول آزمایش:
الایزای رقابتی :Ab ضد 17OHP باند با بیوتین بصورت معرف وجود دارد. نمونه حاوی 17OHP به همراه کونژوگه آنزیم دار و آنتی بادی ضد 17OHP باند با بیوتین به چاهک اضافه می شود. بر اساس غلظت 17OHP آزاد یا متصل به آنزیم کمپلکس ایمنی تشکیل می شود. پس از مدت معین مواد واکنش نداده با شستشو خارج و سوبسترای آنزیم اضافه می شود. در صورت حضور تعداد کافی آنزیم در محیط سوبستراتغییر رنگ داده به محصول تبدیل می شود. با افزودن معرف استاپ که یک محصول اسیدی است تغییر ناگهانی pH رخ داده و فعالیت آنزیم متوقف می شود. شدت رنگ ایجاد شده در فتومتر اندازه گیری می شود که با مقدار هورمون نمونه تناسب عکس خواهد داشت.
5- شرایط نمونه:
نوع نمونه:
نمونه سرم یا پلاسمای تهیه شده از لوله هپارینه از بیمار ناشتا بدون همولیز، لیپمی، کدورت یا زردی
حداقل مقدار نمونه :
50 میکرولیتر
پایداری:
سرم در 8-2 درجه تا 5 روز و در 20- تا 30 روز پایدار است.
نکته: در صورت نمونه گیری از نوزاد حداقل 3 روز از تولد گذشته باشد. در عین حال نوزاد زودرس، یا بیمار بدون وجود CAH قطور ممکن است 17 P بالا داشته باشد.
6- مواد، لوازم و تجهیزات مورد نیاز
1- کیت اندازه گیری 17 هیدروکسی پروژسترون الایزا از Monobind
2- سمپلر 25، 50، 100و 350 میکرو لیتری
3- آب مقطر یا دیونیزه، حوله کاغذی، وسایل ایمنی
4- بشر یا مزور 1000-500 میلی لیتری
5- بطری پلاستیکی نیم یا یک لیتری
6- الایزا ریدر و پرینتر
7- الایزا واشر اتوماتیک (اختیاری)
8- تایمر
7- روش انجام آزمایش:
ابتدا کیت را از یخچال خارج کنید تاریخ انقضاء، صحت بسته بندی و سلامت معرفها را چک کنید. 20-15 دقیقه در دمای اتاق بگذارید.
1- از معرف Enzyme Reagent مقدار ml 0.7 بردارید و به ویال – steroid conjugate buffer اضافه کنید . محلول کاری آنزیم آماده شده و در 8-2 درجه نگه دارید.
2- کالیبراتورها، کنترل ها و نمونه های بیمار را مرتب کنید و به دمای اتاق برسانید. از کالیبراتور A و چاهک A1 شروع کنید.
3- د ر هر چاهک 25 میکرولیتر نمونه (یا کالیبراتور یا کنترل) وارد کنید
4- به هر چاهک 50 میکرو لیتر محلول کاری آنزیم (Working enzyme Reagent ) اضافه کنید. سپس 30-20 ثانیه پلیت را آرام بچرخانید.
5- به هر چاهک 50 میکرولیتر معرف 17α OH Progesterone Biotin اضافه کنید.
6- مجدداً 30-20 ثانیه پلیت را آرام بچرخانید. سپس پلیت را بپوشانید و در دمای اتاق بمدت 60 دقیقه انکوبه کنید. در این فاصله معرف واش کاری را بسازید ویال مربوطه را با آب مقطر به حجم 6000 میلی لیتر در مزور یا بشر برسانید و به بطری پلاستیکی منتقل کنید.
7- محتویات پلیت را تخلیه کنید و هر چاهک را با 350 میکرو لیتر واشر کاری (رقیق شده) 3 بار شستشو دهید. پس از شستشوی آخر پلیت را روی حوله کاغذی برگردانید و با چند ضربه ملایم خشک کنید. عدم وجود حباب در چاهک ها را چک کنید در صورت استفاده از واش اتوماتیک برنامه را مطابق بالا تعریف کنید.
8- به هر چاهک 100 میکرولیتر محلول سوبسترا Substrate اضافه کنید و پلیت را تکان ندهید.
9- پلیت را بدون حرکت دادن 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
10- به هر چاهک 50 میکرو لیتر محلول Stop اضافه کنید و 20-15 ثانیه ملایم حرکت دهید.
11- دستگاه الایزا ریدر را روشن کرده فیلتر 450 نانومتر را انتخاب کنید. با هوا صفر کنید و برنامه کالیبراتور یا استاندارد و Best Fit Curve را انتخاب کنید. غلظت استانداردهار ا تعریف کنید سپس پلیت را در دستگاه بگذارید و Start را بزنید.
12- خوانش پلیت تا 30 دقیقه پس از افزودن استاپ ممکن است.
8- کنترل کیفیت:
آزمایش غلظت های خوانش شده کالیبراتور ها و شکل منحنی را چک کنید. در صورت تغییر ناگهانی در جذب نوری کالیبراتور ها علت را بررسی کنید.
A جذب نوری کالیبراتور ng/mL ≥ 1.3
9- نحوه محاسبه نتایج کمّی
1- نتایج نمونه ها بطور خودکار در الایزا ریدر محاسبه می شود. (جذب نوری در محور عمودی و غلظت در محور افقی منحنی قرار می گیرند.)
2- غلظت محاسبه شده بر حسب ng/ml گزارش می شود.
10- محدوده اندازه گیری:
ng/mL 20-0.03
11- محدوده مورد انتظار:
بر حسب واحد ng/mL
0.8-0.2 10-1 سالگی
3.1-0.2 مرد بالغ
0.9-0.2 بعد از یائسگی 4.51-1 فاز لونتال 1.51-0.4 فاز فولیکولر زن بالغ
بارداری
ng/ml هفته
3.3-1.32 6-1
2.8-1.1 14-7
4.62-1.65 24-15
10.2-1.98 33-25
13.2-2.64 40-34
1 دیدگاه
انجام پایان نامه مدیریت
واقعا مطالبتون آموزنده هستند و بسیار زیبا