هموگلوبین F
1- هدف
هدف از تدوين اين دستورالعمل، تشريح انجام آزمایش هموگلوبین F با استفاده از کیت بیوژن می باشد.
2 – دامنه کاربرد
اين دستورالعمل در واحد هماتولوژی برای انجام آزمایش هموگلوبین F بر روی نمونه های خون تام حاوی ضد انعقاد EDTA كاربرد دارد.
3 – مسئولیت اجراء
مسئوليت نظارت بر اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول کنترل کیفیت و سوپروایزر می باشد.
مسئوليت اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول واحد هماتولوژی می باشد.
4 – تعاریف
. HbF، اصلی ترین فرم هموگلوبین در جنین است که در هنکام تولد میزان آن 90-65 درصد می باشد و به مقدار خیلی کم در بزرگسالان دیده می شود. به طورکلی مشاهده HbF بیشتر از 2% در بیماران بالای 3 سال غیر طبیعی محسوب می شود. در خصوصیات HbF آن است که قادر به انتقال اکسیژن در زمانی که مقدار اکسیژن طبیعی کم است. بنابراین در بیمارانی که نیاز به جبران هیپوکسی مزمن طولانی مدت می باشد (اختلالات قلب و عروقی ارثی)، HbF افزایش می یابد جهت کمک کردن به انتقال اکسیژن و افزایش اکسیژن در دسترس می باشد.
تعیین مقدار HbF در افتراق دقیق هموگلوبینوپاتی ها و یا ارزیابی حالاتی که مغز استخوان دچار استرس شده است اهمیت دارد. لذا هر زمان در الکتروفورز باند HbF دیده شود باید حتما با روش شیمیایی تایید گردد.
• عنوان آزمایش
اندازه گیری هموگلوبین F (متد (Betke
• اصول انجام آزمایش
روش های متعددی برای تعیین مقدار HbF وجود دارند از جمله دناتوراسیون قلیایی، کروماتوگرافی، Radio Immuno Assay ,(RIA) ELISA و آنالیز آمینو اسیدها. ولی تقریبا هیچ یک از روش ها قادر به اندازه گیری HbF در محدوده صفر تا 100 درصد نمی باشد. روش دناتوراسیون قلیایی بدلیل سهولت انجام بیشتر از بقیه استفاده می شود.
HbF بر خلاف سایر هموگلوبین های انسان، نسبت به دناتوراسیون قلیایی مقاوم است. در این روش ابتدا همولیزیت قلیایی می گردد و سپس هموگلوبین های دناتوره رسوب داده می شوند. آنگاه جذب نوری مایع رویی (Supernatant) که حاوی هموگلوبین مقاوم به قلیا می باشد در طول موج 540 نانومتر خوانده و درصد HbF محاسبه می گردد.
5- شرایط نمونه :
• حداقل مقدار نمونه :
500 میکرولیتر
• نوع نمونه :
خون تام EDTA
• شرایط نمونه برداری :
ناشتایی ضرورتی ندارد.
• شرایط نگهداری و پایداری:
خون تام: یک هفته در دمای 8-2 درجه سانتی گراد در یخچال همولیزیت: 3 ماه در فریزر
• شرایط رد یا قبول نمونه :
خون لخته و همولیز بودن
6- مواد ، لوازم و تجهیزات
کیت هموگلوبین F (بیوژن) ، سمپلر 500 و 200 ، سرسمپلر آبی – آب مقطر -جا لوله ای- کرونومتر، پارافیلم، پی پت5 ،10، 2سی سی، سرم فیزیولوژی، دستگاه اسپکتروفتومتر
7-روش انجام آزمایش:
• ابتدا نمونه و معرف ها را از یخچال بیرون بیاورید تا به دمای محیط برسند(18-25 درجه).
• ورک کاری خود را تهیه کنید.
• نمونه ها را به ترتیب در راک چیده و شماره گذاری کنید.
• تهیه همولیزیت:در مورد هر بیمار 1 سی سی خون CBC را سه بار با 5 سی سی سرم فیزیولوژی شستشو می دهیم (به مدت 5 دقیقه با دور 2000) و سپس در مرحله آخر شستشو که تمام مایع رویی را خالی کردیم 300 میکرولیتر از Packed cell را با 4 سی سی از R1 ( معرف درابکین)کیت هموگلوبین F مخلوط کرده سه دقیقه Time میگیریم.
• سپس 8/2 سی سی از همولیزیتی را که تهیه کردیم با 200 میکرولیتر از R2 (معرف قلیایی ) مخلوط کرده و 2 دقیقه Time می گیریم
• بلافاصله بعد از اتمام 2 دقیقه 2 سی سی R3 ( سولفات آمونیم اشباع) به محلول اضافه می کنیم و سریع مخلوط می کنیم.
• سپس 15 دقیقه با دور 3000 سانتریفیوژ می کنیم و بعد از سانتریفیوژ محلول روئی را در لوله دیگر ریخته و این مایع روئی را دوباره 2 دقیقه با دور 3000 سانتریفیوژ می کنیم. مجددا قسمت رویی را در لوله دیگری ریخته آن را HbF می نامیم.
• برای ساختن Total: 400 میکرولیتر از همولیزیتی که درست کردیم را با 75/6 آب مقطر مخلوط کرده و با طول موج 540 نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتر خوانده می شود .
• ابتدا دستگاه اسپکتوفتومتر را با آب مقطر صفر یا بلانک می کنیم .بعد ODR3 و ODHbF و ODHbTotal خوانده و از طریق فرمول زیر در صد هموگلوبین Fمحاسبه می گردد
ODHbF – ODR3
——————– × 10 =HbF%
ODHb Total
توجه: اگر جذب نوری لوله ها از یک بیشتر شد، باید محلول ها را با سرم فیزیولوژی رقیق کرده و پس از قرائت مجدد جذب، فاکتور رقت را در محاسبه مد نظر قرار دهید.
• نتیجه آزمون دستی باید در نتیجه الکتروفورز قید شود و توسط مسئول فنی صحه گذاری گردد.
7- کالیبراسیون :
ندارد.
8- کنترل کیفیت :
در هر ران کاری علاوه بر نمونه بیماران یک نمونه با هموگلوبین F بالا (بیش از 10%) ویک نمونه با غلظت نرمال را نیز تست کنید. برای تهیه نمونه با غلظت بالا میتوان نمونه خون بند ناف و نمونه طبیعی را به نسبت مختلف با یکدیگر مخلوط نمود.
بعلاوه بهتر است نمونه بیماران را به صورت دوپلیکیت تست کنید. در این صورت تفاوت جذب نوری ( ODHbF 1 , 2 & TOTAL1,2 ) آنها نباید از 0.1 بیشتر باشد تا بتوانید میانگین آنها را به عنوان جواب نهایی رد کنید. در غیر اینصورت باید مجددا تست را تکرار نمایید.
9- نحوه محاسبه نتایج در روش های کمی :
درقسمت متد فرمول ارائه شده است.
10- محدوده مرجع (Reference Interval) :
در بزرگسالان و کودکان بالای یکسال HbFکمتر از 1 درصد است. اما در یک درصد افراد نرمال هموگلوبین F بدلایل نامعلوم بیشتر از2درصد می باشد که احتمالا منشا ژنتیکی دارد.
11- محدوده قابل اندازه گیری Reportable Range :
بیشترین حساسیت این روش در مواردیست که HbF کمتر از 10 درصد هموگلوبین کل است.
مقادیر بالاتر از 50% باید نمونه همولیزیت با متد Jonix and Visser تست شوند.
HEMOGLOBIN F Normal Ranges
1-30 days : 22.8 – 92.0 %
1-2 months : 7.6 – 89.8 %
3-5 months : 1.6 – 42.2 %
6-8 months : 0.0 – 16.7 %
9-12 months : 0.0 – 10.5 %
13-17 months : 0.0 – 7.9 %
18-23 months : 0.0 – 6.3 %
>or = 24 months : 0.0 – 0.9 %
12- محدوده هشدار یا مقادیر بحرانی :
ندارد.
• • ملاحظات ایمنی:
استفاده از دستکش هنگام کار با نمونه و تمیز یا ضد عفونی کردن سطوح بعد از پایان کار.
هنگام کار با محلول شماره 1 احتیاط لازم را به عمل آورید.(حاوی سیانور می باشد).
محلول شماره 3 در دمای اتاق ممکن است کریستال بزند لذا برای استفاده از قسمت فوقانی محلول بردارید.
13- ویژگی های آنالیتیک (خصوصیات و کارآیی آزمایش):
ندارد.
14- محدودیت های انجام آزمایش (منابع بالقوه تغییر پذیری) :
• کربوکسی هموگلوبین A هم به دناتوره شدن قلیایی مقاوم است ( این هموگلوبین در خون افراد بشدت سیگاری بالاست.)
• پی پت کردن نادرست (استفاده از حجم نادرست معرف ها یا همولیزیت)
• عدم رعایت زمان ها (کرونومتر بالفاصله بعد از افزودن معرف باید بکار انداخته شود.)
• مخلوط کردن نامناسب (کلیه مخلوط کردنها باید بلافاصله انجام شود ( به کمک بستن لوله با پارافیلم و نه با شیکر)
• مشکل در اسپکتروفتومتر (تنظیم نادرست طول موج)
• استفاده از معرف قلیایی کهنه که خاصیت خود را از دست داده است.( معرف قلیایی در ظروف شیشه ای به سرعت خاصیت خود را از دست میدهد. بهترین ظرف از نوع پلاستیکی دردار می باشد و بهترین دما: دمای یخچال)
• رقیق بودن همولیزیت باعث کسب نتایج بالاتر می شود. غلظت هموگلوبین همولیزیت باید در محدوده 80-100 g/l باشد .
• کدر بودن مایع رویی بعد از سانتریفوژ و یا باقی ماندن ذرات قهوه ای در مایع رویی که قرار است با اسپکت خوانده شود.
• عدم رعایت دمای مناسب جهت انجام آزمایش
15- اقدامات بعدی دربرخورد با نتایج غیر طبیعی :
مقایسه با باند های موجود در الکتروفورز هموگلوبین و در صورت لزوم تکرار تست یا نمونه گیری..
16- عوامل مداخله گر :
هموگلوبین نادر Hb Rainier و Hb Bethesda به قلیا مقاوم است و ممکن است در تفسیر آزمایش تداخل داشته باشد. (باعث افزایش کاذب HbF شود).
• تداخلات دارویی :
ندارد.
17- چگونگی تفسیر نتایج :
منحنی تجزیه اکسیژن HbF در مقایسه با HbA به سمت چپ شیفت می کند که سبب تسهیل انتقال اکسیژن جفتی می شود اختلالات ارثی متعددی از ساختمان زنجیره گاما شرح داده شده ولی اکثرا بدون اهمیت بالینی هستند بجز HbF Poole که سبب بیماری همولیتیک نوزادان می شود.
• موارد افزایش:
1- تقریبا در نیمی از بیماران مبتلا به تالاسمی هتروزیگوت (ماینور بتا تالاسمی یا B-thalassemia trait) مقدار HbF، 2 الی 5 درصد است اما در بیماران مبتلا به بتا تالاسمی هموزیگوت میزان آن تقریبا همیشه افزایش قابل ملاحظه ای دارد و معمولا به 65 الی 100 درصد می رسد.
2- در بیمارانی که از نظر ژن HbS هموزیگوت هستند، HbF ممکن است طبیعی و یا تا 20 درصد باشد اما در افرادی که از نظر ژن HbS هتروزیگوت می باشند میزان HbF معمولا طبیعی است.
3- چنانچه مقدار HbF، 5 الی 20 درصد باشد ممکن است بیمار مبتلا به δβ-thalassemia و یا پایداری ارثی هموگلوبین جنینی باشد. وجود میکروسیتوز واضح به نفع مورد اول است. در مورد دوم تست سیتوشیمیایی Kleihauer یک توزیع پان سلولار را نشان خواهد دادو البته در بیمارانی که مبتلا به هیچیک از اختلالات هماتولوژیک آشکار نیستند ولی HbF آنها 10 الی 15 درصد است باید بوجود ژن پایداری ارثی هموگلوبین جنین مشکوک شد.
4- افزایش متوسط مقدار HbS (در حدود 2 الی 5 درصد) در برخی موارد اسفروسیتوز ارثی، آنمی های هایپوپلاستیک، لوسمی های حاد و مزمن، آنمی میلوفتیزیک، آنمی پرنی شیوز درمان نشده، اریترولوکمیا، آنمی های مقاوم به درمان، PNH و کارسینوم دارای متاستاز به مغز استخوان گزارش شده است.
5- مقدار HbF در کودکان مبتلا به آنمی آپلاستیک ارثی یا اکتسابی ممکن است بیشتر از 10 درصد و در کودکان مبتلا به شکل Juvenile لوسمی میلوژنوس مزمن بیشتر از 30 درصد باشد. میزان HbF طی بارداری معمولا افزایش می یابد و ممکن است تا 15 درصد نیز برسد.
6- در بارداری نرمال: ممکن است HbF تا غلظت 10 -5 % افزایش یابد (سه ماهه دوم)
• موارد کاهش:-
18- سایر موارد :
ندارد.
19- مدارک مرتبط
ورک لیست کاری ، بروشور کیت،
20 – مراجع و ضمائم
Tietz Text Book Of Clinical Chemistry
Clinical Biochemistry 42 (2009) 1797 – 1801
دیدگاه خود را درج کنید