هموگلوبین الکتروفورز

هموگلوبین الکتروفورز

الكتروفورز عبارت است از حركت يك جسم باردار در يك ميدان الكتريكي در PH معين.

پروتئین ها درPH ایزو الکتریک خود دارای بارهای منفی ومثبت برابرند، بنابر این در PH   قلیائی دارای بار منفی شده وبطرف قطب مثبت حرکت می کنند. در طی این حرکت جدا سازی صورت میگیرد. هموگلوبين نرمال در افراد بالغ (HbA) ، در بافر قليايي داراي شارژ منفي است و به طرف آند حركت مي كند .

جداسازی بیشتر انواع هموگلوبين هاي غيرطبيعي ازهموگلوبین A بدلیل ساختمان غير طبيعي آنها که معمولا” يك آمينواسيد جایگزین آمينو اسيد ديگرشده است ، بر اساس تغییر در شارژ الكتريكي شان صورت می گیرد.

جدا سازی الکتروفورتیک روشی ساده برای شناسائی مقدماتی بسیاری از هموگلوبین ها می باشد.

الكتروفورز استات سلولز جهت بررسي هموگلوبينوپاتیها :

انواع مختلف حامل (Supporting media) وجود دارد که حامل های سلولزی از متداول ترین آنها می باشد.

مزایا: سهولت استفاده ،جدا سازی سریع هموگلوبین های A، F ، Sو) C با جذب کم(،حمل آسان ونگهداری طولانی مدت با قرار دادن در کیسه پلاستیکی

معایب: عدم شناسائی اجزائی از هموگلوبین با غلظت کم،عدم جدا سازی همه انواع هموگلوبین بخصوص هموگلوبین های ناپایدار.هم چنین هموگلوبین های F و A در کنار هم جدا می شوند که ممکن است مقادیر کم هر یک در برابر مقدار بالای دیگری قابل جدا سازی نباشند.

آماده سازي نمونه                                                                                                                                    – نمونه مورد استفاده در الكتروفورز ، هموليزات است كه ترجيحا” از گلبولهاي قرمز شسته شده تهيه مي شود. يك جداسازي خوب الكتروفورتيك ، عموما” از همولیزاتی با غلظت هموگلوبين در محدوده 3-2 گرم در دسی ليتربدست می آید.

– ضد انعقاد مصرفی CPD , ACD , EDTA يا Heparin می باشد وخون دردمای 4درجه به مدت10 روزقابل نگهداری است. ( خون هاي هپارينه در طول نگهداري ممكن است تشكيل لخته های بسیار کوچک بدهند .)

– در صورت استفاده از كيت، مطابق با دستورالعمل آن عمل کرده و از محلول ليزكننده داخل كيت جهت تهیه همولیزات استفاده مي كنيم .

– در صورتيكه بيمار مشكوك به يك هموگلوبينوپاتي از نوع ناپايدار باشد ، سلولها فقط باید با آب مقطر ليزگردند و از حلالهای آلی جهت تهیه همولیزات نباید استفاده شود چون باعث رسوب وتغییر ماهیت این هموگلوبین ها میشود.

تجهيزات

• مخزن الكتروفورز : داراي مخازن نگهداري بافروپل هايي است كه استات سلولز روي آن قرار مي گيرند.
• منبع تغذيه : بايد دستگاه يك ولتاژ ثابت جريان مستقيم داشته باشد و داراي اتصال زمين باشد تا مانع شوك به کاربر شود. مجهز به تايمر60-0 دقیقه ، قادر به تأمين ولتاژ 450 و كليد قطع و وصل اتوماتيك باشد ، بطوری که تا قطع کامل جریان برق امکان باز نمودن درب مخزن وجود نداشته باشد.
• محيط استات سلولز : بايد با اطمينان از عدم پارگي محيط (Medium) به آن دست بزنيم. معمولا” استات سلولز به يك ورقه پلاستيك متصل مي شود.
• اپليكاتور: نمونه گذاري ميتواند با هر وسيله مناسبي كه بتواند µl5- 1از نمونه را در سطح محيط قرار دهد انجام گيرد . مقادير نمونه گذاري شده بايد يكسان باشد.
• بافر TEB – اين بافرعموما” در محدوده 4/8-2/9 = PH استفاده ميشود بافر مرسوم دارای 4/8PH= است.

طرز تهيه بافر Tris – EDTA – Boric Acid ( TEB ) :

– پودر تريس هيدروكسي متيل آمينومتان     2/10گرم

– EDTA                                     6/0گرم

– اسيد بوريك                                   2/3گرم

– آب مقطر تا حجم                            1000 ميلی ليتر

بافر فوق تا قبل از کدورت و تغییر رنگ در دمای 4 درجه قابل مصرف است.

رنگ

در الكتروفورز استات سلولزمی توان از هر نوع رنگ آميزي مناسب پروتئين ها استفاده نمود. به طــور اعــم با رنگ Panceau S ( W/V ) 3/0-5/0 درصد كـه داراي5 درصد ( W/V ) تري كلرواستيك اسيد می باشد نتايج خوبي مشاهده مي می گردد.

– پانسو S ، 300-500 ميليگرم

تری کلرو استيک اسيد ، 5 ميليگرم

آب مقطر تا 100 ميلی ليتر

• Counter staining: جهت افتراق پروتئين هاي هم از غير همHem) (، نوار را می توان با يك رنگ ويژه هم(Hem) ،Counter stain كرد . براي اين منظور از بنزيدين استفاده مي شود که بدليل كارسينوژنيك بودن آن ساير رنگهاي ويژه همHem) ) مانند :

O – tolidine dihydrochloride

O – dianisidine ( 3 , 3´ dimethoxybenzidine )

نیزتوصيه مي شود.

محلول هاي رنگ بر ، آب گير ، شفاف كننده

• اسيد استيك (V/V) 3-5 درصد ( رنگ بر )
• متانول95 -100 درصد ( آب گير )
• اسيد استيك در متانول ( V/V)20درصد ( شفاف كننده )

با چند بار تعويض در اسيد استيك 3-5 درصد ، زمينه را بي رنگ كنيد.

روش كار

روش کار بر اساس دستور العمل هر توليدكننده صورت می گیرد. مراحل زیر بطور معمول در اکثر روش ها اجرا می شود:

• نوار استات سلولز را به آرامي در بافر فرو ببرید تا از ايجاد حباب هوا جلوگيري كند.(اشباع کردن در بافر)
• دو مخزن تانک را به طور مساوي با بافر پر كنيد.
• نوار اشباع شده را از بافر خارج نموده و به سرعت بين دو ورقه كاغذ جاذب الرطوبت قرار داده ورطوبت اضافي را به طور يكنواخت بگيريد.
• نمونه هاي هموليزات را بر روي استات سلولز ، در طول يك خط و در فاصله يك سوم طول ورقه از لبه كاغذ قرار دهيد. نتايج خوب عموما” با مقادير 5/0-1ميکرو ليتراز هموليزات مشاهده مي شود.
• نوار استات سلولز را طوري بر روی پل مخزن قرار دهيد كه محل نمونه گذاري به كاتد نزديكتر باشد.
• مطمئن شويد سمت استات سلولزنوار به طرف بافر ( پائين ) است.
• ولتاژ 250-400 ولت ( عموما” 350 ) را در زمان مورد نظر برقرار كنيد .) بسته به نوع و اندازه نوار استات سلولز و كارخانه توليدكننده متغير است. )
• پس از زمان مورد نظر ، نوار را از مخزن بيرون آورده ، بر اساس دستور العمل درون کیت رنگ آميزي ، شفاف و خشك كنيد.

ملزومات حركت

     ٭ کنترل

در هر بار الکتروفورز استات سلولز بایداز يك نمونه كنترل حاوي هموگلوبین های A , F , S , C        در کنار نمونه های بیماران استفاده نمود..

– نوسانات كم جريان برق ، شماره سریالهاي مختلف بافر ونوار استات سلولز ، ممكن است سبب تغييرات كم در سرعت حركت در الکتروفورز شود.

– الگوي حركت نمونه هاي مجهول را باید با هموليزات نمونه كنترل درهمان نوار مقايسه نمود.

٭ جدا سازی

با هر شماره سریال جديد استات سلولز ، نمونه هايي كه حاوي تركيبي از هموگلوبين هاي F , A و F , S هستند بايد نمونه گذاري شوند و جداسازي مناسب هموگلوبين ها بر روي نوار استات          سلولز آزمایش شود. تفكيك واضح اين هموگلوبين ها باید با يك ناحيه شفاف كوچك بين آنها مشخص شود. ممكن است لازم باشد غلظت هموگلوبين ها را در نمونه كاهش داده يا زمان و ولتاژ را جهت مشاهده تفكيك دقيق باندها تنظيم شود.

فتوتيپ

منظوراز فنوتیپ، هموگلوبین های عمده ای است که به فرم باند مجزا درالكتروفوراستات سلولز قابل مشاهده می باشند.

– در گزارش هموگلوبينوپاتي ها ، هموگلوبيني كه غلظت آن بيشتر است ، ابتدا نوشته مي شود . وقتي غلظت HbA بيشتر است ، الگوي فرم هتروزيگوت آن مثلا” در سيكل سل هتروزيگوت يا HbC هتروزيگوت به صورت HbAC يا HbAS نوشته ميشود.

-اگر دو نوع هموگلوبين تقريبا” در مقادير مساوي حضور داشته باشند. آن يكي كه از نظر باليني اهميت بيشتري دارد اول نوشته مي شود. مثلا” (HbSC)

-هموگلوبينوپاتي هايي نظير HbS هموزيگوت يا HbS / β – thal اغلب با يك افزايش در HbF همراه شده اند. اين مسئله قسمتي از ژنوتيپ نيست ( بلكه مسئله اي جبراني است . ) البته به جز در^* HPFH .

– در برخي موارد تشخيص انواع هموگلوبينوپاتي ها از يكديگر مشكل است مثلا” در شكل

( β˚ – thal ) ، HbA كاملا” غايب است والگو β˚thal HbS / از نوع هموزيگوت HbS غير قابل تشخيص است .

ژنوتیپ

ترکیب اختصاصی آللیک ژن یا مجموعه ژنها در سطح DNA می باشد.

شرح بيان ژنتيكي كامل انواع هموگلوبين ها ، نياز به روش هاي آزمايشگاهي تائیدی ، مطالعات          خانواده گي ( شجره نامه ) و مطالعات باليني دارد.

منابع خطا

تشخيص قطعي هموگلوبينوپاتي بر اساس الكتروفورز در PH واحد امکان پذیرنمی باشد در عین حال این روش با وجود مشخص نمودن هموگلوبینهای مختلف، مقدار کمی وصحیح هر هموگلوبین را نیز نشان نمی دهد. اما تفاوت های آشکار را میتوان تخمین زد.

• كدورت و آلوده گي بافر ، بافر با PH يا قدرت يوني نامناسب .
• آلوده گي چاهكهاي نمونه گذاري ، اپليكاتور، blotter ها ( كاغذهاي جاذب الرطوبت ) ، يا   آلوده گي پليت استات سلولز با گرد و خاك ، خون يا ساير پروتئين ها .
• كدورت يا مستهلك شدن (تغییر رنگ) هموليزات :

– هموليزات كهنه ، حاوي استروماي گلبول قرمز، يا آلود گي باكتريال ممكن است جداسازي شان خيلي ضعيف باشد ، آرتفكت بدهند و يا باندهاي هموگلوبين به صورت Smear ديده شوند. ( تفكيك نشوند )

– تشكيل هموليــزات قهــوه اي رنگ ممكن است مربوط به ايجاد مت هموگلوبين در نمونه هاي كهنه و يا نمونه هايي كه بطور مناسب نگهداري نشده اند باشد. در صورت وجود مت هموگلوبين در نمونه خون، باندهاي كوچكي در سمت كاتديك باندهاي هموگلوبين اصلي ديده مي شود

باافزودن يك قطره سيانيد پتاسيم (KCN)5 درصد به هموليزات، مت هموگلوبين به سيان مت هموگلوبين تبديل مي شود ، در نتيجه اگر مت هموگلوبين به عنوان آرتفكت در نمونه وجــود داشته باشد ( در نمونـــه اي كه به خــوبي نگهداري نشده ) باند ضعيف مت هموگلوبين دیگر ديده نمي شود. با اين روش مي توان جوابهاي مبهم و گيج كننده را از بين برد و يك جواب واضح بدست آورد.

• مكش نامناسب بافر درنوار استات سلولز ، سبب حبس شدن هوا يا پوسته پوسته شدن ورقه مي شود.
• blotting نامناسب نوارهای استات سلولز ، سبب خشك شدن استات سلولز يا باقي ماندن رطوبت روي آن مي شود.
• تأخير در : الف) نمونه گذاري روي نوارهاي blot شده ، ب) در برقراري جريان الكتريسته ، ج) در بيرون آوردن نوارها از مخزن ، د) در رنگ آميزي نوارها بعد از الكتروفورز سبب ايجاد خطا مي شود.
• مقدار نمونه گذاري نامناسب باشد . ( خيلي زياد يا كم )
• قراردادن نمونه ها بطور نامناسب بر روي نوار استات سلولز سبب ایجاد خطا مي شود. نمونه ها بايد نسبت به مركز به صورت كاتديك قرار گيرند تا فضاي مناسب را جهت حركت هموگلوبین به سمت آند فراهم كنند.
• بخار شدن زياد رطوبت نوارها در مدت الكتروفورز ( مثلا”بدنبال حرارت بالا ، جريان خيلي بالا و غلظت هاي بالاي بافر ) كه در اين حالت اگر دماي اتاق بالا تراز 25 درجه باشد، خنك كردن دستگاه توسط کیسه یخ( Icebag ) ضرورت پيدا مي كند.

10 (عدم برداشت لكوسيت ها در بيماران مبتلا به لكوسيتوز ، ممكن است يك باند غيرطبيعي از پروتئين هم Hem) )ايجاد کند.اين باند حركت آنديك سريعتر از هر هموگلوبيني دارد ( حتي سريعتر از HbH ) و ممکن است ناشی از میلو پراکسیداز لکوسیتی باشد.

11) در بيماران ديابتي كه تحت كنترل پزشك نيستند ، باندی كه نسبت به HbA کمی آنديك تر است ، به دليل حضور هموگلوبين گليكوزيليت مشاهده مي شود.

الکتروفورز سیترات آگار

درالکتروفورز سیترات آگار جدا سازی هموگلوبین ها بر اساس واکنش متقابل بین هموگلوبین ، آگار و یونهای بافر سیترات صورت می گیرد.

نمونـــه گذاري :

– نمونه هاي هموليزات را به آرامي به سطح آگار منتقل كنيد.

– نمونه گذاری باید به فاصله 3سانتی متر ازانتهاي آنديك و يا در مركزنوار صورت گیرد.

– در هنگام نمونه گذاري از آسیب رساندن به سطح آگار اجتناب کنید.

– HbS و HbC به طرف آند حركت کرده ، در حاليكه HbA و HbF به طرف كاتد حركت مي كنند.

– در هربار الكتروفورز سيترات آگار بايد ازنمونه خون كنترل حاوي هموگلوبين هاي C,S,F,A استفاده کرد وباندهای جدا شده را در مقایسه با نمونه کنترل تفسیر نمود.

– در صورتيكه به هموگلوبين Hb Oarab مشكوك هستيد ، باید از نمونه كنترل حاوی این هموگلوبين استفاده كنيد.

– در بعضي انواع تجارتي پليت هاي آماده سيترات آگار ، HbO با HbS حركت مي كند.

مزاياي روش سيترات آگار

1- الكتروفورز سيترات آگار همزمان وجود هموگلوبين ها یC,S,F,A و انواع نادر ديگر را تأئيد مي كند. اين روش بين هموگلوبين هاي O,E,C افتراق مي گذارد و HbS را از انواع نادر ديگر كه مشابه HbS در الكتروفورز قليايي حركت مي كند تشخيص مي دهد.

2- اين روش تشخيص انواع هموگلوبينوپاتي ها را از طريق نشان دادن مقادير كم HbF و HbA در حضور مقادير زياد ديگر هموگلوبين ها آسان مي كند.

3- الكتروفورز سيترات آگار به عنوان روش ثانويه براي غربالگری خون بند ناف مفيد است . زيرا HbF را به آساني از HbA و HbS جدا مي كند و مقادير كم هموگلوبین بالغین را كه در زمان تولد وجود دارد آشكار مي سازد.

محدوديت هــا

1) الكتروفورز سيترات آگار نمي تواند به عنوان يك روش غربالگری اوليه برای شناسائی هموگلوبين هاي غیرطبیعی كمك كننده باشد. چون بسیاری از انها علی الرغم شارژالكتريكي شان نظیر HbAیا HbF(در موارد مشکوک به واریانت های هموگلوبين فتال) حرکت میکنند.

2)در صورت تهیه پليت هاي آگار درآزمایشگاه نمی توان آن را به مدت طولاني نگهداري کرد ، چون خراب شده ( گاهي اوقات حتي بعد از يكماه ) و ضريب اطمينان آنها بايد به طور متناوب با نمونه هاي كنترل چك شوند.

3) حرکت هموگلوبین ها می تواند به عوامل مختلف وگسترده ای ( در مقایسه با سایرروشها ) نظیر غلظت ونوع هموگلوبين، تغییردر خصوصیات بافرو جریان الکتریکی وابسته باشد. لذا استفاده هم زمان از نمونه کنترل بسیار مهم است.

4) رنگ آميزي های ساده پروتئين نظير پانسو S ، به دليل آنكه جذب آگار مي شوند قابل استفاده نمی باشند.

منابع خطــا

منابع خطا همانند روش استات سلولز مي باشد.

منابع:

– Detection Of Abnormal Hemoglobin Using Cellulose Acetate        Electrophoresis NCCLS   Vol.14   No.10       2005

-Hematology A combined Theoretical And Technical Approch       1997

-Citrate Agar Electerophoresis For Confirming The Identification Of Variant Hemoglobins     NCCLS     Vol.8   No.6             2003

*Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin        

آزمایشگاه پاتوبیلوژی سپند

http://sepandlab.ir