تست PT

تستPT
هدف از تدوين اين دستورالعمل، تشريح روند انجام آزمایش PT می باشد.

2 – دامنه کاربرد
اين دستورالعمل در واحد هماتولوژی برای انجام آزمایش تست PT بر روی نمونه های پلاسمای سیتراته كاربرد دارد.
3 – مسئولیت اجراء
مسئوليت نظارت بر اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول کنترل کیفیت و سوپروایزر می باشد.
مسئوليت اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول واحد هماتولوژی می باشد.
4 – تعاریف تست PT
تست PT برای ارزیابی مسیر خارجی (extrinsic pathway) و مسیر مشترک (Common pathway) استفاده می شود.
ترومبوپلاستین بافتی در حضور یون کلسیم، فعال کننده مسیر خارجی سیستم انعقادی است که شامل فاکتورهای 7، 10، 5، 2 (پروترومبین)، 1 (فیبرینوژن) است. بنابراین تست PT برای غربالگری قبل از جراحی، بررسی کمبود فاکتورهای انعقادی ذکر شده و همچنین مانیتورینگ بیمارانی که تحت درمان با داروهای ضد انعقاد خوراکی (آنتاگونیست ویتامین K) هستند کاربرد دارد و همچنین به عنوان تستی برای ارزیابی عملکرد کبد در نظر گرفته می شود.
اولین واکنش بدن در مقابل خونریزی، انقباض عروق می باشد که در جراحت های عروق کوچک همین مکانیسم برای بند آوردن خونریزی کافی است.
فاز اول در مکانیسم هموستاتیک شامل تجمع پلاکتی (platelet aggregation) در عروق خونی است. سپس مرحله دوم هموستاز آغاز می شود. این مرحله از دو مسیر آغاز می شود. مسیر داخلی با فعال شدن فاکتور ІІ در اثر تشکیل کمپلکس با کلاژن ساب اندوتلیال عروق آسیب دیده آغاز می شود.
Intrin sic pathway
ІІ ІІa
І Іa
І Іa
+VІІІ
 a
Extrinsic pathway
Tissue thromboplastin (ІІІ)
Factor VІІ VІІa

همینطور فاکتور VІІa می تواند فاکتور І را نیز فعال کند.

X a Common pathway
Prothrombin thrombin

Fibrinogen Fibrin (monomer) stoge
І Factor بین پلی مرهای فیبرین پیوند متقاطع تشکیل داده و باعث محکم تر شدن لخته می شود.
تقریبا بلافاصله 3 اکتیواتور اصلی سیستم فیبرینولیتیک بر روی پلاسمینوژن اثر کرده و آنرا تبدیل به پلاسمین می کنند. پلاسمین باعث دژنره شدن پلی مرهای فیبرین شده و این قطعات به آسانی توسط ماکروفاژها پاک سازی می شود.
تست PT، فعالیت انعقادی مسیر خارجی و مشترک را اندازه گیری می کند (یعنی فاکتورهای І، ІІ، V، VІІ، (X کاهش این فاکتورها باعث طولانی شدن تست PT می شود. این فاکتورها در کبد سنتز می شود. بنابراین در بیماری سلولهای کبدی که فونکسیون سلولها کاهش می یابد کاهش ——- میزان فاکتور VІІ باعث طولانی شدن تست PT می شود.
برای یکسان سازی جذب PT در تمام کشورها، سازمان بهداشت جهانی (WHO) توصیه که تمام جوابهای تست PT باید شامل مقادیر (International Normalized Ratio) INR باشد. چرا که INR دیگر وابسته به متد (مکانیکال یافته اُپتیکال) و معرف های (ترومبوپلاستین = که با توجه به Source مورد تهیه آن می تواند جواب های بسیار متغیری در نتایج تست PT یک بیمار ایجاد کند)
مقدرا درمانی INR بین 2 تا 5/3 در بسیاری از وضعیت های کلینیکی می باشد
مشتقات کومارین، زمان اثر شان کند بوده ولی اثرشان بین 7 تا 14 روز بعد از قطع دارو می ماند. داروهایی مثل آسپرین، qunidine، ایندومتاسین باعث افزایش اثر کومارین ها می شود و بر عکس باربیتوراتها، قرص های ضد بارداری خوراکی (OCPS) بدلیل افزایش میزان Binding کومارین ها باعث کاهش اثر آنها می شود.
• عنوان آزمایش
آزمایش تست PT
• اصول انجام آزمایش
در این آزمایش بررسی فاکتورهای انعقادی مسیر خارجی با استفاده از روش دستی است.
5- شرایط نمونه :
• حداقل مقدار نمونه :
100-500 لاندا
• نوع نمونه :
پلاسمای حاصله از 3 cc خون سیتراته.
• شرایط نمونه برداری :
ناشتایی ضرورتی ندارد. اگر بیمار وارفارین دریافت می کند باید قبل از دریافت دوز روزانه اش نمونه گیری انجام شود.
• شرایط نگهداری و پایداری:
لوله وکیوم سیتراته با درب آبی که پس از سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه دور 3000 rpm پلاسمای آن در لوله پلاستیکی جدا می شود و تا زمان انجام آزمایش (حداکثر 3 ساعت) در یخچال نگهداری شود.
معرف ترومبوپلاستین که به صورت لیوفیلیزه می باشد تا تاریخ انقضا پایدار می باشد و پس از حل شدن در بافر به مدت 8 ساعت در دمای اتاق و 5 روز در2-8 درجه پایدار است بافر در صورت آلوده نشدن به مدت حداقل 6 ماه پایدار است.
• شرایط رد یا قبول نمونه :
نمونه های دارای لخته، دارای همولیز، نمونه ای که در ضد انعقاد نا مناسب جمع آوری شده، نمونه ای که نسبت خون و ضد انعقاد در آن رعایت نشده، نمونه ای که پلاسمای آن بیش از زمان مجاز مانده و در شرایط مناسب نگهداری نشده است.
6- مواد ، لوازم و تجهیزات
– سمپلر
– سر سمپلر
– نمونه پلاسما
– کنترل (Pooled Plasma)
-کورنومتر
– بن ماری 37co
– کیت Thermo
– چراغ مطالعه
7-روش انجام آزمایش:
1-200 لاندا محلول ترومبوپلاستین را درون لوله بریزید 5 دقیقه در بن ماری 37 co بگذارید.
2-100 لاندا از نمونه پلاسمای بیمار را که به دمای 37 co رسیده (حداقل 2 دقیقه در 37 درجه مانده است) به ترومبوپلاستین اضافه کنید .
3- بلافاصله کورنومتر را به کار اندازید.
4- بعد از 5 ثانیه لوله را بیرون بیاورید و در مقابل نور به آرامی تکان دهید.
5- به محض تشکیل لخته کورنومتر را متوقف کنید.
6- زمان را ثبت نمائید.
توجه اگر تا 60 ثانیه لخته ای تشکیل نشد بعد از تکرار تست نتیجه را به صورت بیشتر از 60 ثانیه گزارش نمائید.
8- کنترل کیفیت :
به دستورالعمل کنترل کیفیت آزمایشهای کمی (Quantitative) مراجعه شود .
• دستورالعمل سریع کنترل کیفیت
در هر run جهت کنترل کیفی از Pccc1 (غلظت نرمال) و Pccc2 (غلظت پاتولوژیک) استفاده می شود. اعداد بدست آمده برای هر کنترل در منحنی Levey-jennings نقطه گذاری می گردند. در صورتیکه که قانونی نقض شده باشد با توجه به نوع آن اقدام لازم بعمل می آید. به عنوان مثال اگر قانون مربوط به خطای دقتی باشد (مثل 13S,R4S) بار دیگر کنترل به دستگاه داده می شود. اگر قانون مربوط به خطای سیستماتیک باشد (مثل 22S, 41S, 10X) احتمالا خطا مربوط به کالیبر نبودن تست می باشد. لذا تست را کالیبر کنید. دوباره کنترل را بدهید. در صورتیکه مشکل همچنان باقیست، معرف (کنترل، کالیبراتور، کیتها) و دستگاه را چک کنید. به عنوان مثال: ابتدا کنترل جدیدی تهیه کنید. اگر مشکل رفع نشد کالیبراتور جدیدی تهیه کنید اگر مشکل رفع نشد کیت جدیدی را امتحان کنید. اگر مشکل رفع نشد برنامه های مربوط به عملکرد دستگاه را بررسی کنید. چنانچه به نتیجه نرسیدید با شرکت اکبریه تماس بگیرید و مشکل را مطرح نمایید. چنانچه با عدم همکاری شرکت مذبور روبرو شدید با مسئول فنی موضوع را مطرح کنید.
در ابتدای هر شیفت کاری کنترل پلاسما قبل از نمونه بیماران آزمایش شود. هر زمان Lot.No کیت نیز عوض شود باید کنترل مجدا تست شود.
پلاسما کنترل: تجاری یا غیر تجاری ساخت آزمایشگاه (با استفاده از حداقل 4 پلاسما از افراد نرمال) توجه شود که نمونه نباید از زنان باردار ،زنانی که قرص ضد بارداری مصرف کرده اند و افرادی که وارفارین، هپارین و یا آسپیرین مصرف می کنند تهیه شود.

9- نحوه محاسبه نتایج در روش های کمی :
INR با توجه به میزانPT از روی جدول خوانده می شود. INR (International Normalized Ratio) واحد یا نسبت همسو شده بین المللی است که توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) تعریف شده است. ترمبوپلاستین (که مخلوطی از پروتئین فعال کننده فاکتور بافتی و فسفولیپید است) که به عنوان معرف در تست PT به کار می رود. از منابع گوناگون استخراج می شود. به عنوان نمونه می توان از بافت مغز (بویژه مغز خرگوش)، ریه و جفت حیوانات مختلف برای تهیه ترومبوپلاستین به کار می رود. این منابع نسبت به کمبود فاکتور های مسیر خارجی انعقاد (که توسط تست PT چک می شود) دارای حساسیت یکسانی نیستند، از این رو یک آزمایشگاه بدنبال مصرف معرف هایی که از منابع متفاوت استخراج شده اند، دچار نوساناتی در ارائه نتایج آزمایش می شود. سازمان بهداشت جهانی برای از بین بردن این نوسانات حاصل از تفاوت منابع تولید و روش های ساخت کیت و برای غیره وابسته کردن تست به آنها، واحد INR را پیشنهاد کرده است.
INR به روش زیر محاسبه می شود.
INR = ( بیمار بر حسب ثانیه PT ) ISI
کنترل یا نرمال بر حسب ثانیه PT
: International Sensitivity Index :ISI شاخص حساسیت بین المللی است. استاندارد جهانی برای ترومبوپلاستین، مغز انسان است و در نتیجه ISI برای این بافت ویژه برابر 1 است. هر چه حساسیت منابعی که برای تهیه کیت از آن استفاده شده (مثل مغز خرگوش) به عدد 1 نزدیکتر باشد. حساسیت کیت نیز بیشتر بوده و به استانداردمرجع هم نزدیکتر است. هر چه تست PT با کیت های غیر حساس (ISI بالا) انجام شود، زمان PT در کمبود عوامل انعقادی مسیر خارجی چندان طولانی نمی شود و جواب در محدوده جزیی بالاتر از نرمال گزارش می شود. اما در کیت های حساس، کمبود خفیف فاکتور های انعقادی باعث طولانی شدن سریع تست PT می شود. با استفاده از INR این اثر از بین رفته و تنها شاخص استاندارد برای پایش و تنظیم دوز مصرف وارفارین طی درمان است.
10- محدوده مرجع (Reference Interval) :
0/2± ثانیه از پلاسما کنترل در افراد تحت درمان با ضد انعقاد این میزان 5/1 تا 2 برابر عدد پلاسما کنترل افزایش می یابد.
11- محدوده قابل اندازه گیری Reportable Range :
5 ثانیه – 60 ثانیه
12- محدوده هشدار یا مقادیر بحرانی :
بیشتر از 20 ثانیه در افراد نرمال و بیشتر از 3 برابر کنترل پلاسما در افراد تحت درمان

• • ملاحظات ایمنی:
استفاده از دستکش و عینک در هنگام انجام آزمایش
13- ویژگی های آنالیتیک (خصوصیات و کارآیی آزمایش):
پلاسمای نرمال 0.9% و پلاسمای غیر طبیعی 2.1%
Expected Bias = ≤ 5.3 %
Expected CV within : ≤ 2.0 %
Ewpected CV between : ≤ 2.0 %
14- محدودیت های انجام آزمایش (منابع بالقوه تغییر پذیری) :
ضد انعقادهای دیگر مثل سدیم اگزالات، EDTA و هپارین برای انجام تست مناسب نمی باشد. آزمایش با پلاسما و محلول گرم شده در 37 درجه انجام نشده است. نسبت خون به ضد انعقاد درست نمی باشد.
15- اقدامات بعدی دربرخورد با نتایج غیر طبیعی :
در صورت بیشتر یا کمتر بودن از محدوده مرجع تست با تکرار صحه گذاری می شود.
16- عوامل مداخله گر :
• تداخلات دارویی :
افزایش : آلوپورنیول- آنتی بیوتیک های بتالاکتام – سفالوتین ها- کلرامفنیکل- سایمتیدین- الکل-کینین- سولفانامیدها- هپارین- متیل دوپا- نئومایسین- کولستیرامین- کلوفیبرات- آسپیرین- باربیتوراتها- کلروپرومازین کورتون
کاهش: آنتی هیستامین- باربیتال ها -کافئین- قرص ضد بارداری- ویتامین K- فنوباربیتال
17- چگونگی تفسیر نتایج :
ترومبوپلاستین فقط در دمای 5/0±37 خوب واکنش می دهد .
• موارد افزایش:
1- بیماری های کبدی سلولار (مثل سیروز و هپاتیت، مراحل متاستیک سرطانها) کمبود ارثی فاکتورهای انعقادی (مانند فاکتورهای X-VII-V-II)کمبود ویتامین K ، انسداد مجاری صفراوی (مانند انسداد مجاری صفراوی ثانویه به تومور یا سنگ صفراوی، انسداد داخل کبدی مجرای صفراوی ثانویه به Sepsis یا داروها). از آنجائیکه املاح صفراوی برای جذب چربی از دستگاه گوارش —— هستند و در نتیجه در انسداد مجاری صفراوی Fat malabsorption رخ می دهد. ویتامین A، D، E، K از آنجائیکه در چربی محلول بوده و در نتیجه در این اختلال جذب نمی شود. از آنجائیکه سنتز فاکتور های ІІ، VІІ، І،  و پروتئین های C وS وابسته به ویتامین K(نقش کوفاکتور را برای آنزیم های کبدی کربوکسیلاز دارد) می باشد. اولین فاکتوریکه کاهش می یابد فاکتور VІІ می باشد.
برای افتراق بیماری پارانشیم (هپاتوسلار) کبدی از بیماری های انسدادی کبدی، تجویز ویتامین K به بیماران (به صورت Im و دو بار در یک روز به مقدار mg15) است. اگر بعد از یک الی سه روز PT نرمال شد نشانه فرم انسدادی بیماری کبدی می باشد.
2- مصرف کوکائین و یا وارفارین و نگهداری نمونه به صورت در باز باعث افزایش pH و تغییر نتیجه می شود همچنین نگهداری نمونه در لوله شیشه ای باعث تغییر نتیجه نمونه می شود.
مصرف مشتقات کومارین مثل دی کومارول (dicumarol) و وارفارین (کومارین و panwarfin)، که برای پیشگیری از تشکیل ترومبوز در بیمارانی که مبتلا به بیماری های ترومبوآمبولی ( مثل آمبولی ریوی، ترومبوفلبیت، آموبولی شریانی). این داروها از طریق تداخل با ویتامین K باعث مهار سنتز فاکتورهای فوق می شود. بنابراین برای مانیتورینگ تاثیر درمان، می توان از تست PT استفاده نمود. مناسبترین درمان کو مارین ها باید طوری باشد که PT را به 1.5 الی 2 برابر مقادیر نرمال برساند.
3- نوشیدن الکل بدلیل آسیب کبدی می تواند PT را افزایش دهد.
4- در موارد اسهال با سندرم های سوء جذب (malabsorption syndromes)می تواند باشد طولانی تر شدن PT شود (بدلیل کاهش جذب ویتامین K).
5- نقص ارثی فاکتورهای انعقادی (Hereditary factor doficiency) = سنتز فاکتورها به صورت ژنتیک دچار نقصان می شود و در نتیجه PT افزایش می یابد.
6- انعقاد منتشر داخل عروقی (Disseminated Intravascedar coagulation = DIC) مصرف فاکتورها افزایش می یابد و در نتیجه PT افزایش می یابد.
7- مسمومیت با سالیسلاتها
8- انتقال خون وسیع: مهار فاکتورهای انعقادی بدلیل وجود مواد ضد انعقاد (موجود در مسیر های خون)
• موارد کاهش:
1- نگهداری پلاسما در 4-8 co می تواند باعث پایین آمدن نتیجه شود.
2- مصرف غذاهای پر چرب یا سبزیجات پر برگ (Leafy Vegetable) بدلیل افزایش جذب ویتامین K باعث کوتاهتر شدن PT شود.
18- سایر موارد :
نمونه های لیپمیک، کدر و یا واجد همولیز می تواند نتایج نادرستی در پی داشته باشد. اگر بیمار در حال دریافت ترکیبات وارفارینی می باشد. اگر درد در ناحیه پشت داشته باشد (back Pain) نشانه ای از خونریزی پشت صفاق (retroperito – neal bleeding) می باشد.
19- مراجع و ضمائم
بروشور کیت و کتاب تفسیر تست های تشخیصی Pagana & Pagane سال 2005
20 – مدارک مرتبط
جدول Bias & CV مجاز-Log Book بن ماری-دستور جداسازی سرم و پلاسما