آنتی بیوگرام (Antibiogram)

1- هدف
هدف از تدوين اين دستورالعمل، تشريح روند انجام آزمایش و کنترل کیفی تست حساسیت داروئی یا آنتی بیوگرام (Antibiogram) می باشد.
2 – دامنه کاربرد

اين دستورالعمل در واحد میکروبشناسی برای تشخیص حساسیت میکروبی بر روی باکتری های جدا شده از کشت تمامی مایعات و قسمت های مختلف بدن كاربرد دارد.
3 – مسئولیت اجراء
مسئوليت نظارت بر اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول کنترل کیفیت و سوپروایزر می باشد
مسئوليت اجرای صحیح این دستورالعمل بر عهده مسئول واحد میکروب شناسی می باشد.
4 – تعاریف
بخش مهمی از آزمایشات انجام شده در بخش میکروب شناسی ارزیابی حساسیت باکتریای ها نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف است. بنابراین این تست می تواند راهنمای پزشک در انتخاب آنتی بیوتیک مناسب و تجویز آن به بیمار باشد.
• عنوان آزمایش
تست آنتی بیوگرام
• اصول انجام آزمایش
جهت انجام آنتی بیوگرام از کشت خالص میکروارگانیسم استفاده می شود. باکتری ابتدا با استفاده از استاندارد کدورت 5/0 نیمه مک فارلند کدورت سنجی شده و بر روی محیط مولر هینتون آگار کشت داده می شود. آنتی بیوتیک های خاص هر نوع باکتری نیز صرفا برای باکتری مورد نظر استفاده شده، انتخاب دیسک ها نیز با توجه به دستور العمل CLSI انتخاب می شود.
5- شرایط نمونه :
• حداقل مقدار نمونه :
کدورت برابر با استاندارد 5/0 مک فارلند (cfu/e 1.5×108)
• نوع نمونه :
کشت خالص باکتری
• شرایط نمونه برداری :
ندارد
• شرایط نگهداری و پایداری:
حداکثر 15-10 دقیقه پس از تهیه سوسپانسیون و کدورت سنجی با استاندارد کدورت.
• شرایط رد یا قبول نمونه :
ندارد
6- مواد ، لوازم و تجهیزات
1- محیط مولر هینتون آگار
2- دیسک های آنتی بیوتیک مطابق جدول CLSI
3- استاندارد کدورت 5/0 مک فارلند
4- سوآب و پنس استریل
5- نرمال سالین استریل
6- خط کش
7- روش انجام آزمایش
1- با استفاده از لوپ استریل کلنی های خالص را برداشت کرده ودر سرم فیزیولوژی استریل حل کرده تا کدورتی برابر 5/0 مک فارلند تهیه شود. دقت کنید که لوپ با خود محیط کشت تماسی پیدا نکند و فقط با نوک کلنی ها برخورد نماید.
2- کدورت سوسپانسیون حاصل را با لوله نیم مک فارلند مقایسه نمایید. در صورت نیاز کلنی یا سالین به لوله اضافه کنید.
3- یک سوآب استریل را داخل سوسپانسیون میکروبی فوق وارد نموده و رطوبت اضافی سوآب را با فشردن و چرخاندن سوآب به دیواره لوله بگیرید.
4- سوآب مذبور را در 2 جهت پلیت مولر هینتون کشت دهید. در آخر سوآب را یک دور نیز در اطراف پلیت کشت دهید.
5- در پلیت را ببندبد و 5- 3 دقیقه صبر کنید تا سوسپانسیون خشک شود.
6- دیسک های مورد نظر را با استفاده از پنس استریل در فواصل یکنواخت بر روی محیط مولر هینتون بگذارید. ( بر روی پلیت های 9-7 سانتی حد اکثر 5 دیسک باید گذاشت )
7- پس از گذاردن هر دیسک، کمی بر روی آن فشار دهید تا کاملا با محیط تماس پیدا کند.
8- پلیت های مولر هینتون فوق را بلافاصله در انکوباتور 35 درجه بگذارید. (در فضای انکوباتور CO2 نباید موجود باشد)
9- بعد از طی مدت انکوباسیون (18-16 ساعت= overnight)، قطر منطقه ممانعت از رشد دیسک ها (که شامل قطر خود دیسک نیز می باشد) را با خط کش برحسب میلی متر اندازه گرفته، یادداشت نمائید.
10- نتایج را با استفاده از “جدول استاندارد CLSI آنتی بیوگرام” تفسیر نمائید.
8- کنترل کیفیت :
جهت کنترل دقت و صحت دیسک های آنتی بیوگرام باید همزمان با انجام تست بر روی نمونه های بیماران، با استفاده از سویه های استاندارد نسبت به کنترل کیفی دیسک های مورد استفاده اقدام بعمل آورید. در مورد ارگانیسم استاندارد، قطر مورد انتظار از منطقه ممانعت از رشد، با توجه به جداول موجود را تعیین کرده و آنگاه با قطرمنطقه ممانعت از رشد بدست آمده مقایسه کرده. در صورتی که نتایج در محدوده غیر قابل قبول باشد نشانه ای از وجود خطای تکنیکی و یا عدم کفایت دیسک ها می باشد.
سویه های استاندارد مورد استفاده در کنترل کیفی:
– استافیلوکوکوس اروئوس ((ATCC 25923
– E. coli ((ATCC 25922
– سودوموناس آئروژینوزا ((ATCC 27853
این تست ها باید هر هفته یکبار، یا به ازای هر 5 بار انجام تست آنتی بیوگرام، یا به ازای هر سری جدید ساخت محیط مولر- هینتون آگار و یا سری جدید دیسک های آنتی بیوتیک انجام گردد. روش انجام تست مشابه تست آنتی بیوگرام می باشد. همچنین کنترل کیفی محیط مولر هینتون با استفاده از سویه انتروکوکوس فکالیس ATCC(29212)ودیسک SXT با منطقه ممانعت از رشد با قطر بیش از 20mm انجام می شود.
9- نحوه محاسبه نتایج در روش های کمی :
ندارد
10- محدوده مرجع (Reference Interval) :
بر اساس نوع باکتری و جدول تفسیر حساسیت میکروبی.
11- محدوده قابل اندازه گیری Reportable Range :
مطابق با جدول CLSI
12- محدوده هشدار یا مقادیر بحرانی :
بسته به نوع باکتری سریعا جواب داده و موارد مقاومت دارویی باید سریعا گزارش شوند.

• • ملاحظات ایمنی:
استفاده از دستکش، ماسک و کنار شعله وزیر هود کار شود تا سوسپانسیون مورد نظر به فرد انجام دهنده آزمایش تماس پیدا نکند.
13- ویژگی های آنالیتیک (خصوصیات و کارآیی آزمایش):
انجام این آزمایش راهنمایی است که پزشک می تواند آنتی بیوتیک درمانی مناسب برای بیمار را تجویز کند.
14- محدودیت های انجام آزمایش (منابع بالقوه تغییر پذیری) :
حتما باید روی کشت خالص باکتری آزمایش صورت گیرد.
15- اقدامات بعدی دربرخورد با نتایج غیر طبیعی :
سریعا گزارش کرده و پزشک را مطلع کرده.
16- عوامل مداخله گر :
در تست آنتی بیوگرام (متد دیسک دیفیوژن) عوامل تکنیکی زیر در اندازه منطقه مهار از رشد موثر می باشند:
1- غلظت ماده تلقیحی:
• چنانچه سوسپانسیون میکروبی خیلی رقیق باشد، منطقه ممانعت از رشد بزرگتر خواهد بود. در این حالت ممکن است سویه های نسبتا مقاوم به صورت حساس گزارش شوند.
• اگر ماده تلقیحی خیلی غلیظ باشد، اندازه منطقه ممانعت از رشد کم خواهد شد و ممکن است سویه های حساس به عنوان مقاوم گزارش شوند.
2- زمان استفاده دیسک:
• اگر بعد از تلقیح ارگانیسم روی محیط مولر هینتون مدت طولانی سپری شود، ممکن است تکثیر ارگانیسم قبل از گذاشتن دیسک ها صورت گیرد. این امر موجب کاهش قطر منطقه ممانعت از رشد و لذا سویه حساس به عنوان مقاوم گزارش خواهد شد.
3- دمای انکوباسیون:
• تست حسایست به مواد آنتی میکروبیال در حالت نرمال در دمای 35 درجه انجام می شود. اگر دما در مدت انکوباسیون کمتر از حد مذکور باشد، زمان لازم برای رشد موثر طولانی تر خواهد بود لذا منطقه ممانعت از رشد بزرگتری حاصل خواهد شد.
4- زمان انکوباسیون:
• در بیشتر تکنیک ها مدت انکوباسیون بین 16 تا 18 ساعت می باشد. با اینحال در موارد اورژانس می توان بعد از 6 ساعت یک گزارش مقدماتی تهیه کرد.
5- اندازه پلیت، عمق آکار و فضای بین دیسکها:
• تستهای آنتی بیوگرام معمولا روی پلیتهای 10-9 سانتی انجام می شود. در این صورت نباید بیش از 5 دیسک روی پلیت گذاشته شود. اما اگر ناچار به استفاده از آنتی بیوتیکهای بیشتری هستید، باید از 2 پلیت و یا از یک پلیت 14 سانتی استفاده نمایید ( فضای مناسب بین دیسکها برای جلوگیری از روی هم قرار گرفتن هاله و یا دفرمه شدن آنها در لبه پلیت جلوگیری می کند).
• در صورت استفاده از محیط های خیلی نازک ممکن است منطقه ممانعت از رشد بسیار بزرگی مشاهده شوند.
6- قدرت دیسک آنتی بیوگرام:
• قطر منطقه ممانعت از رشد مهاری با مقدار داروی موجود در دیسک ارتباط دارد. از اینرواگر مقدار دارو به علت خراب شدن دیسک کم شده باشد، اندازه منطقه ممانعت از رشد مهار رشد نیز متناسبا کاهش خواهد یافت.
7- ترکیب محیط:
• محیط کشت با تاثیر بر سرعت انتشار آنتی بیوتیک و فعالیت عامل بر اندازه منطقه ممانعت از رشد اثر دارد. لذا ضرورت دارد تا برای هر متد از محیط مناسب آن استفاده شود. ارتفاع محیط مولر هینتون آگار باید 4mm باشد.
• تداخلات دارویی :
17- چگونگی تفسیر نتایج :
قطر منطقه ممانعت از رشد اندازه گیری شده و با جدول استاندارد تطبیق داده شده و تحت عنوان مقاوم و حساس و میانه گزارش می شود.
• موارد افزایش:
ندارد
• موارد کاهش:
ندارد
18- سایر موارد :
انتهای هاله مهار رشد با چشم مشخص می باشد. اما سه مورد استثنا نیز وجود دارد که باید به آنها توجه داشت:
• در مورد سولفونامیدها و کوتریموکسازول رشد مختصری نیز در داخل منطقه ممانعت از رشد دیده می شود که چنانچه 80% از رشد ممانعت بعمل آورده باشد چشم پوشی می شود.
• ممکن است برخی گونه های پروتئوس داخل منطقه ممانعت از رشد اطراف دیسکها بخزند. اما معمولا این منطقه واضح است و وجود لایه نازکی از این سوآرمینگ را باید نادیده گرفت. همچنین در هنگام انتخاب دیسک باید شرایط سنی بیمار و باردار بودن بیمارنیز مورد توجه قرار گیرد.
19- مدارک مرتبط
دستور العمل راهنمای انتخاب دیسک
20 – مراجع و ضمائم
CLSI 2012
.