تعیین جنسیت جنین از روی خون مادر

تعیین جنسیت جنین از روی خون مادر

مقدمه

در حال حاضردر اكثر كشورها تشخيص  جنسیت جنین در چند ماه اوليه بارداري به منظور پيشگيري از بروز اختلالات ژنتيكي، در آزمايشگاههاي ژنتيك پزشكي مورد توجه مي­باشد. بهرحال روشهاي معمول تهيه سلول­هاي جنيني براي بررسي ژنتيكي از جمله آمنيوسنتز و نمونه­گيري از پرزهاي كوريوني روش­هاي تهاجمي بوده و خطر سقط و آسيب جنين وجود دارد .

در سال 1997 ، Lo و همكارانش توانستند حضور DNA جنيني آزاد را در سرم و پلاسمای زنان باردار را شناسايي نمايند (2). در تحقيقاتی دیگر، آنها نشان دادند كه غلظت DNA جنيني با افزايش سن بارداري افزايش مي­يابد (3) و DNA جنيني پس از زايمان بسرعت از پلاسمای مادر حذف مي­گردد (4). با توجه به وجود DNA جنيني در ميان انبوه DNA آزاد مادري موجود در پلاسما يك مانع بزرگ در راه كسب اطلاعات از اين منبع، فقدان ماركرهاي اختصاصي در تمايز اين دو نوع DNA از نظر منشاء ميباشد. با توجه به تمايز واقعي توالي­هاي DNA كروموزوم Y از DNA پلاسمايي مادر، بررسي­هاي زيادي بر پايه چنين توالي­هایي بعنوان ماركرهاي اختصاصي DNA جنيني انجام شده است. اين كارهاي تحقيقاتي، يك روش تعيين جنسيت با صحت بالا را فراهم ساخت كه براي بررسي  بيماري­هاي وابسته به جنس مفيد مي­باشد. بررسي DNA آزاد پلاسمای مادر براي تعيين غيرتهاجمي وضعيت گروه خوني RhD جنين در زنان باردار RhD منفي نیز مفيد مي­باشد. تاييد صحت اين روش توسط تعداد زيادي ازگروه­هاي تحقيقاتي باعث گرديد كه اداره ملي خون انگلستان (British National Blood Service) آن­را بعنوان يك سرويس معمول از سال 2001 معرفي نمايد. به تازگي بررسي DNA پلاسمای مادر به منظور تشخيص والديني غيرتهاجمي بتا تالاسمي ماژور، HbE، ميونيك ديسترفي، سيستيك فيبروزيس، بيماري هانتينگتون و هيپرپلازي مادرزادي آدرنال مورد استفاده قرارگرفته است (5،6) و چنين كاربردهایي در سالهاي آينده گسترش بيشتری خواهد يافت. همچنين مدت كوتاهي پس از تعيين حضور DNA جنيني در خون مادران باردار، Lo و همکاران متوجه شدند كه در آسيب­ها و ناهنجاريهاي جنيني، DNA جنيني موجود در پلاسمای مادر از نظر كمي متحمل تغيير مي­گردند (7). اولين آسيب جنيني كه با تغييرات كمي DNAجنيني مشاهده گرديد، پره­اکلامپسی بود كه يك افزايش 5 برابري در غلظت DNA جنيني در آن رخ مي­دهد. تغيير كمي DNA جنيني در جريان خون مادر همچنين در تغييرات تعدادي كروموزوم، زایمان پیش از موعد، هیپرامزیس گراویداروم و Placentation تهاجمي نیز مشاهده مي­گردد. بنابراين مكان استفاده از غلظت DNA جنيني در پلاسما يا سرم مادران باردار براي پيش بيني خطرات بارداري وجود دارد (10-8). هدف از اين تحقيق توسعه روشی بي­خطر براي تشخيص پيش از تولد جنسیت جنین مي­باشد.

مواد و روشها تعیین جنسیت جنین

در اين تحقيق تجربي، بر اساس موارد ذيل Nested-PCR براي ژن SRY انساني طراحي و بهينه سازي گرديد. ما با مراجعه به بانك اطلاعات ژني، مقرهاي مختلف واقع بر كروموزوم Y را مورد بررسي و ارزيابي قرار داديم كه از ميان آنها ژن تعيين‌كننده جنسيت (SRY) كه در مقر Yp11.3 قرار دارد، تعيين گردید. ژن (Sex determination region of Y) SRY يك ژن فاقد اينترون بوده كه فاكتور رونويسي از خانواده پروتئين­هاي متصل شونده بهDNA، HMG را رمز مي‌نمايد. اين ژن Kb 8/3 طول داشته و يك پروتئين 204 اسيد ‌آمينه‌اي و 24 كيلودالتوني را رمز مي‌نمايد. اين پروتئين تعيين جنسيت مذكر در انسان را آغازمي نمايد.

5 ميلي ليتر خون كامل همراه با ماده ضدانعقادEDTA  از 32 زن باردار درسنین بارداري بين 8 تا 12 هفته به روش  نمونه­ گيري قابل دسترس با اطلاع و كسب رضايت آنها  جمع­آوري گرديد. خون هر فرد بلافاصله در 3000 دور در دقيقه سانتريفوژ و پلاسما به ميزان 500 ميكروليتر درون ميكروتيوب­هاي استريل تقسيم گرديد. به غير از يكي مابقي ميكروتيوب­ها به منظور تكرار بررسي در فريزر 20- درجه سانتی­گراد ذخيره گرديد.

برای استخراجDNA از روش فنلي استخراج گردید. به 500 ميکروليتر پلاسما 10 ميکروليتر پروتئيناز K(mg/ml 10) اضافه کرده و به مدت 60 دقيقه در دماي 55 درجه سانتيگراد انکوبه شد. سپس هم حجم آن به آن فنل تعادلي اضافه کرده و بخوبي مخلوط شد. سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ شد. فاز آبي را جدا کرده و هم حجم آن کلروفرم اضافه شد و به مدت 1 دقيقه مخلوط گشت. سپس به مدت 5 دقيقه در 12000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. سپس فاز آبي جدا شده و نصف حجمش به آن استات آمونيوم 7 مولار و برابر حجم کل به آن ايزوپروپانول اضافه شد. پس از 15 بار سر و ته کردن نمونه، حداقل به مدت يک ساعت در دماي20- ذخيره شد. سپس به مدت 15 دقيقه در 12000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. رسوب با 500 ميکروليتر اتانول 70% شستشو داده و پس از خشک کردن در دماي 65 درجه سانتي­گراد، به آن 12 ميکروليتر آب مقطر استريل اضافه شد و پس از حل شدن 10 ميکروليتر براي واکنش PCR استفاده شد. جذب نوري آن در طول موج 260 نانومتر نیز اندازه­گيري شد.

برای استخراج DNA از روش Salting out نیز استفاده شد. به 500 ميکروليتر پلاسما 10 ميکروليتر پروتئينازK (10mg/ml) اضافه کرده و به مدت 60 دقيقه در دماي 55 درجه سانتيگراد انکوبه شد. سپس 200 ميکروليتر کلريد سديم 6 مولار به آن اضافه و مخلوط شد. سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ شد. فاز آبي جدا شده و هم حجمش به آن ايزوپروپانول اضافه گشت. پس از 15 بار سر و ته کردن نمونه، حداقل به مدت يک ساعت در دماي20- ذخيره شد. سپس به مدت 15 دقيقه 12000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. رسوب با 1 ميلي ليتر اتانول 70% شستشو داده و پس از خشک کردن در دماي 65 درجه سانتيگراد، به آن 12 ميکروليتر آب مقطر استريل اضافه شد و پس از حل شدن، 10 ميکروليتر آن براي واکنش PCR استفاده شد. همين­طور جذب نوري آن در طول موج 260 نانومتر اندازه­گيري شد.

برای استخراج DNA از روش Boiling اصلاح شده نیز استفاده شد. به 500 ميکروليتر پلاسما، 50 ميکروليتر سود 2 مولار اضافه شد و پس از مخلوط کردن به مدت 5 دقيقه در دماي 105 درجه سانتيگراد قرار داده شد. پس از رسيدن دماي آن به دماي اتاق، 100 ميکروليتر اسيد کلريدريک 6 مولار اضافه شد. سپس در 12000 دور در دقیقه سانتريفوژ به مدت 10 دقيقه انجام گرفت. فاز آبي جدا شده و هم حجم آن به آن کلروفرم اضافه شد و به مدت 1 دقيقه مخلوط و سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقيقه سانتريفوژ شد. فاز آبي جدا شده و هم حجمش به آن ايزوپروپانول اضافه شد. پس از 15 بار سر و ته کردن نمونه، حداقل به مدت يک ساعت در دماي20- ذخيره شد. سپس به مدت 15 دقيقه در 12000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. رسوب با 1 ميلي ليتر اتانول 70% شستشو داده و پس از خشک کردن در دماي 65 درجه سانتيگراد، به آن 12 ميکروليتر آب مقطر استريل اضافه شد و پس از حل شدن 10 ميکروليتر براي واکنش PCR استفاده شد. همينطور جذب نوري آن در طول موج 260 نانومتر اندازه­گيري شد.

براي تعيين جنسيت جنين ما با استفاده از Nested-PCR بخشي از ژن SRY اختصاصي كروموزوم Y را تكثير نموديم. براي اپتيماسيون سيستم PCR، واكنش تكثير بر روي DNA ژنومي استخراج شده از سرم مرد و زن بطور مجزا اجرا گرديد و ميزان مناسب اجزاء واكنش، زمان و دما تعيين گرديد. شرايط اجرای واكنش بصورت زير مي­باشد:

در دور اول واكنش PCR، ما يك قطعه bp 343 از ژن اختصاصيSRY را به كمك جفت پرايمر

Y1(5′-TCG TGT GGT CTC GCG ATC AGA C-3′)                                                     Y2(5′-TGG CCT AGC TGG TGC TCC ATT G-3′

تكثير نموديم. مخلوط واكنش دور اول PCR در حجم 25 ميكروليتر شامل 10 ميكروليتر DNA پلاسما، 5 پيكومول هر يك ازپرايمرها،50 ميكرومول dNTPs ،5 ميلي­مولار MgCl2 ،100 ميلي­مولار pH 9 Tris-HCl،500 ميلي­مولار KCl، 1% Triton X-100 و 1 واحد Taq DNA polymerase بود. برنامه واكنش PCRدور اول به صورت 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقيقه به عنوان دناتوراسيون اوليه و سپس سيكل اصلي واكنش شامل 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانيه، 62 درجه سانتی­گراد به مدت 40 ثانيه، 72 درجه سانتی­گراد به مدت 50 ثانيه ، 43 دور تكرار گرديد و مرحله آخر 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقيقه به عنوان گسترش نهايي بوسيله سيستم ASTEC PCR (Japan) اجرا گرديد.

در دور دوم واكنش PCR، 3 ميكروليتر از محصول PCR دور اول بعنوان DNA الگو در حجم كل 25 ميكروليتر با مقادير يكسان با دور اول از نظر اجزاء واكنش همراه با پرايمرهاي زير اجراء گرديد:

Y3 (5′-AATTACAGGCCATGCACAC-3′)

Y4 (5′-ATTCTTGAGTGTGTGGCTTTG-3′)

برنامه واكنش دور دوم PCR شامل دناتوراسيون اوليه 94 درجه سانتی­گراد به مدت 2 دقيقه، سپس 40 دور سيكل حرارتي اصلي، 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانيه، 61 درجه سانتی­گراد به مدت 40 ثانيه، 72 درجه سانتی­گراد به مدت 50 ثانيه و يك مرحله گسترش 5 دقيقه­اي در دماي، 72 درجه سانتی­گراد اجراء شد. قطعه تكثيري دور دوم واكنش يك قطعه bp 190 بود.
تعیین جنسیت جنین

يافته­ ها تعیین جنسیت جنین

روي پلاسمای 33 زن باردار در هفته هاي 8 تا 12 بطور مجزا سه روش استخراج DNA یعنی روش­های فنلي، Salting out و Boiling انجام شد. پيش از اجرای واکنش PCR روي آنها ميزان جذب نوري هر نمونه در هر روش در طول موج­هاي 280، 260 و 230 نانومتر اندازه­گيري شد. متوسط DNA استخراج شده به روش Boiling، Salting out و فنلي از حجم يکسان پلاسمای 33 زن باردار به ترتيب معادل 35/1، 85/1 و 36/3 بود. ميزان پروتئين و پلي­ساکاريد در رسوب نهايي در روش Salting out بيشتر از روش Boilingو در روش Boiling بيشتر از روش فنلي بود.

نتايج بهينه­سازي سيستم بصورت Multiplex PCR روي DNA ژنومي زن و مرد در شكل 1 نمايش داده شده است. در اين سيستم PCRباند اختصاصي Xو Y حضور اين كروموزوم را در مخلوط DNAنشان مي­دهد. در اين تصوير همچنين تكثير قطعات اختصاصي كروموزوم Xو Y بصورت Single PCR نيز اجرا گرديده است. بطوري­كه حضور قطعه bp 343 نشان دهنده كرموزوم Yو حضور قطعه bp 211 نشان دهنده كروموزوم X مي­باشد. زماني­كه DNAيك مرد تحت واكنش فوق قرار گيرد، بدليل داشتن هر دو كروموزوم X و Y در محصول تكثيري هر دو قطعه bp343 و bp 211 مشاهده مي­گردد. در حالی که وقتی DNA يك زن مورد بررسي قرار مي­گيرد، بدليل داشتن تنها كروموزوم X در محصول واكنش تنها قطعه bp 211 مشاهده مي­گردد.

تعیین جنسیت جنین

شكل1- محصول Multiplex PCR روي ژل آگاروز 5/1 درصد.

ستون شماره 1: حاوي 100 bp DNA Lader.

ستون شماره 2: Multiplex-PCR روي DNA ژنومي فرد مذكر.

ستون شماره 3: Single-PCR با پرايمر هاي X1,X2.

ستون شماره 4: Single-PCR با پرايمر هاي Y1,Y2.

ستون شماره 5: Single-PCR با پرايمرهاي Y1,Y2 روي DNA فرد مذكر.

ستون شماره 6: Single-PCR با پرايمرهاي Y1,Y2 روي DNA فرد مونث.

ستون شماره 7: كنترل منفي.

نتايج حاصل از بررسي غير تهاجمي ژن SRY اختصاصي كروموزومY روي DNA آزاد پلاسمای مرد، زن و مادران باردار از طريق سيستم Nested-PCR در شكل 2 نمايش داده شده است. در اين تصوير نتايج تكثير بر نمونه­هاي DNA استخراجي از پلاسمای زنان باردار در هفته­هاي هشتم تا دوازدهم و پلاسمای فرد مونث و مذكر به ترتيب بعنوان كنترل منفي و مثبت نشان داده شده است. قطعه تكثيري 190 جفت بازي در نمونه زنان باردار حمل كننده جنين مونث و نمونه كنترل منفي (پلاسمای زنان) مشاهده نمي­گردد، در حالي­كه اين باند 190 جفت بازي در نمونه زنان باردارحمل كننده جنين مذكر و كنترل مثبت (پلاسما مرد) مشاهده مي­گردد. صحت نتايج بوسيله پيگيري افراد پس از زايمان در جدول 1 نشان داده شده است.

جدول 1- مقایسه جنسیت جنین نمونه ها بر اساس یافته­های و پس از زايمان تعیین جنسیت جنین

با توجه به پيگيري تمامي زنان باردار پس از زايمان، نتايج بدست آمده آنها در ماه سوم با نتايج نهايي مقايسه گرديد. صحت تشخيص جنسيت مذکر در پلاسمای 15 زن باردار به سه روش استخراج DNA Boiling، Salting out و فنلي به ترتيب 37، 44 و 93 درصد بود. همچنين هيچ قطعه تکثيري 190 جفت بازي در 18 نمونه زن باردار با جنين مونث در سه روش ذکر شده مشاهده نشد.

شكل 2- نتايج دور دوم PCR ژن SRY Y روي DNA آزاد پلاسمای مرد، زن و مادران باردار از طريق سيستم Nested–PCR.

ستون شماره 1: پلاسمای يك زن باردار در هفته نهم.

ستون شماره 2: پلاسمای مرد (كنترل مثبت).

ستون شماره 3: پلاسمای زن غيرباردار (كنترل منفي).

ستون شماره 4: 100 bp DNA Ladder.

ستونهای شماره 5 تا 8: پلاسمای زنان باردار بين هفته هاي هشتم تا دوازدهم.

بحث تعیین جنسیت جنین

در اين طرح ما با استفاده ازروش بسيار حساس Nested-PCR كه قادر به شناسايي مقادير جزئي DNA مي­باشد و استخراج DNA به روش فنلي، سعي كرديم مقادير جزئي DNA جنيني كه از هفته هشتم وارد جريان خون مادر مي­شود را شناسايي نماييم. براي اين منظور، ما پرايمرهایي براي ژن SRY كه تنها بر روي كروموزوم Y وجود دارد، طراحي نموديم. پس از بهينه­سازي روش روي DNA ژنومي فرد مذكر و مونث، روش روي پلاسمای فرد مذكر، مونث و زنان باردار اجرا گرديد. نتيجه Nested-PCR روي پلاسمای 32 زن با سن آبستني 8 تا 12 هفته­ای و مقايسه آنها با نتيجه پس از زايمان میزان حساسيت 5/87 درصدی این روش را نشان داد. از ميان اين 32 مورد، 4 مورد نتيجه كاذب وجود داشت، بطوري­كه سه مورد جنين مونث، مذكر و يك مورد جنين مذكر، مونث تشخيص داده شده بود. نتايج بدست آمده با نتايج Lo و Birch (9،4) كه به حساسيت و اختصاصيت 100 درصدی دست يافته بودند، كمي كمتر است. نتايج بدست آمده نشان مي دهد که روش استخراج فنلي هم از نظر مقدار DNA حاصله و هم از نظر عدم حضور ساير ماکرومولکول­ها همچون پروتئين و پلي­ساکاريدها که بعنوان مهار کننده­هاي واکنش عمل می­نمايند، در وضعيت بسيار مطلوبي قرار دارد. در حقيقت مقدار DNA بدست آمده در روش فنلي بيش از دو برابر روش­هاي Salting out و Boiling مي­باشد. با توجه به استخراج دستي DNA آزاد پلاسما در اين بررسي، شايد بتوان با استفاده از كيت­هاي استخراج DNA با كارايي بالا به نتايج بهتري دست يافت. در ضمن، از آنجايي­كه جنس مونث، مذكر تشخيص داده شده و اين موضوع ممكن است به خاطر آلودگي سرسمپلرها با نمونه­هاي DNA جنس مذكر باشد و همچنين با توجه به اينكه اكثر قطعات DNA جنيني در جريان خون مادر طولي كمتر از 300 جفت باز (2،11) دارند، با انجام آزمايش در شرايطی با استريلیتی بالاتر و با طراحي پرايمرهایي كه قطعات كوچكتري را شناسايي مي­نمايند، شايد بتوان حساسيت روش را بهبود بخشيد. بطوري­كه دست­يابي به اين مهم مي­تواند به ما در گشايش راه جديدی براي تشخيص پيش از تولد و كاملا بي­خطر طيفي از اختلالات ژنتيكي كمك نمايد.

تعیین جنسیت جنین